Optimización de un protocolo para la obtención de protoplastos de olivo

Abstract

Los protoplastos son una herramienta valiosa en biotecnología y mejora genética vegetal. En olivo, su obtención ha sido poco explorada. En esta investigación se ha desarrollado un procedimiento para el aislamiento de protoplastos procedentes de células embriogénicas (CE) de olivo, derivadas de la radícula de un embrión zigótico del cv. Picual, y hojas de los cvs. Hojiblanca y Leccino establecidos in vitro. Para la obtención de protoplastos a partir de CE se evaluaron dos protocolos: uno desarrollado en hoja y callo no embriogénico de olivo (cvs. Chemlal, Azaradj y Acebuche) (Sahouli et al., 2022) y otro en hojas de zanahoria con pecíolo (Grzebelus et al., 2012). El primero no resultó efectivo, ya que provocó necrosis celular sin liberación de protoplastos. En cambio, el protocolo modificado de Grzebelus basado en el pretratamiento con la solución PSII suplementada con 0,5 M manitol y la digestión enzimática ESIV con 1 % celulasa Onozuka R10, 0,1 % pectoliasa Y-23, 0,6 M manitol, 20 mM MES y 5 mM MgCl2, permitió una liberación limitada de protoplastos. Para mejorar el rendimiento, se incrementó la masa inicial a 2 g y se suplementó la mezcla enzimática con 200 mg/l de caseína hidrolizada, como fuente de aminoácidos, lo que favoreció la viabilidad y estabilidad celular. Finalmente, durante la fase de purificación, se comprobó que un gradiente osmótico adecuado era crucial para la recuperación de protoplastos viables, obteniéndose los mejores resultados con una concentración de sacarosa/MES de 0,7 M, lo que permitió alcanzar una densidad celular de 1·10⁶ protoplastos/ml. Para la obtención de protoplastos a partir de hojas se evaluó un protocolo de Arabidopsis (Yoo et al., 2007). A partir de 0,3 g de hoja y 18h de incubación se pudo obtener una densidad de 3·10⁶ protoplastos/ml. La obtención de microcallos, así como la regeneración completa de plantas a partir de protoplastos está aún en desarrollo.