Acta Botanica Malacitana 22: 35-42	 Málaga, 1997
ECHINOSPARTUM ALGIBICUM (LEGUMINOSAE)
REGENERACIÓN DE PLANTAS MEDIANTE
ORGANOGENESIS ADVENTICIA
Rafael ZÁRATE, Abelardo APARICIO, Manuel CANTOS y Antonio TRONCOSO
RESUMEN. Echinospartum algibicum (Legumittosae) regeneración de plantas mediante organogénesis
adventicia. La germinación in vitro de semillas de E. algibicum, especie endémica de la Sierra de
Grazalema, S de España, así como la inducción de yemas múltiples y el desarrollo posterior de brotes, se
consiguió en el medio de cultivo de Murashige y Skoog a mitad de concentración, con 3% de sacarosa y
citoquinina (BAP) a las concentraciones de I y 2 mg l (ECH-1, ECH-2). La germinación de las semillas
se incrementó significativamente de 38% a casi 100% tras la escarificación. El número medio de yemas
formado después de 35-40 días fue de 8,6 y 6,9 en los medios ECH-1 y ECH-2 respectivamente. Los brotes
fueron posteriormente enraizados en el mismo medio nutritivo pero sustituyendo la citoquinina por la
auxina IBA (0.2 mg 1 1 ). En este medio, se consiguió un porcentaje medio de enraizamiento de 35,49 después
de 25-30 días, y en algunos casos la formación de masas de callo en las zonas de los brotes en contacto con
el medio nutritivo. Finalmente, se ensayó la aclimatación de estas plantas a suelo mediante reducción
progresiva de la humedad relativa y tras varios tratamientos que incluyeron el uso de CO„ la adición de
inoculo de micorriza (Glomus deserticola) al substrato de cultivo, así como el uso de un medio de cultivo
sin reguladores de crecimiento y mitad de sacarosa previo paso a suelo. Los porcentajes dc supervivencia
después de 60 días en suelo fueron mayores para la plantas sometidas a los tratamientos con CO, aunque
los porcentajes medios fueron algo bajos.
Palabras clave. Conservación, Echinospartum, germinación de semillas, micorrizas.
ABSTRACT. Echinospartum algibicum (Leguminosae), plant regeneration via adventitious organo genesis.
In vitro seed germination of E. algibicum, an endangered species, multiple bud induction and shoot growth
was achieved on a growth medium composed of half strength Murashige and Skoog medium, with 3%
sucrose and BAP at 1 and 2 mg (ECH- I , ECH-2). Seed germination increased significantly after
scarification (from 38% to almost 100%). The mean number of buds formed after 35-40 days was 8.6 and
6.9 on ECH-1 and ECH-2 media respectively. Shoots were then rooted on the same medium but substituting
the cytokinin by the auxin IBA (0.2 mg 1 1 ). On this medium the mean maximum rooting percentage was
35.49 after 25-30 days; in some cases, callus formation took place on the shoot areas in contact with the
nutrient medium. Finally, acclimatization of rooted shoots was achieved through progressive reduction of
relative humidity and after several treatments including use of CO 2 , addition of mycorrhizal fungus
(Glomus deserticola) inocula to the substrate, as well as the use of a nutrient medium lacking any plant
growth regulators with half the amount of sucrose, prior transferring to soil. After 60 days in soil, survival
rates were higher for plants treated with CO 2 , although the mean survival percentages were rather low.
Key words. Conservation, Eehinospartum, seed germination, mycorrhiza.
Esta investigación ha sido financiada por la CICYT proyecto número AMB94- 1372.
36	 R. Zárate et al.
INTRODUCCIÓN El objetivo de este trabajo es establecer
un protocolo de micropropagación de E.
El género Echinosparturn, endémico del algibicum con especial referencia a las distintas
sur de Francia y. la Península Ibérica, se fases del proceso de propagación: (a)
compone de cinco especies silicícolas y esterilización y establecimiento del cultivo,
calcícolas, que se localizan habitualmente en (b) multiplicación de yemas, (c) aislamiento
zonas montañosas por encima de 1000 m.s.m. de las yemas-brotes producidos para su
(Rivas Martínez, 1974). Equinospartum desarrollo y posterior enraizamiento y (d)
algibicum ha sido recientemente descrita aclimatación de las plantas ya enraizadas a
(Talavera y Aparicio, 1995), y la única condiciones de suelo. El fin último es conseguir
población que se conoce de esta especie se la aclimatación de plantas y su introducción en
localiza en suelos silíceos de la unidad del el Jardín Botánico del Parque de Grazalema
Aljibe en el Parque Natural Sierra de Grazalema como parte de un proyecto más amplio acerca
(Andalucía, España) entre 800-830 m.s.m.; esta del conocimiento y conservación de esta
especie se encuentra actualmente en peligro de especie.
extinción debido fundamentalmente a la presión
del ganado caprino que somete las plantas a un
intenso ramoneo. La población está integrada MATERIALES Y MÉTODOS
por unos pocos individuos (80-90) de los que
tan solo 3 llegan a florecer y fructificar a) Germinación de semillas y desarrollo de
(Aparicio y Guisande, 1995). Aunque no se yemas adventicias
conoce bien la ecología, biología y sistema de Las semillas, fácilmente reconocibles,
reproducción de esta especie, existen estudios fueron recolectadas en septiembre de 1995 bajo
acerca de la germinación de semillas y una de las plantas que florece, una vez
supervivencia de plantulas para evaluar las finalizada la dispersión. La esterilización se
posibilidades de regenerar esta especie a partir realizó mediante inmersión en etanol 80%
del banco permanente de semillas que existe en durante 30 segundos, seguida de 25 min. en
el suelo (Aparicio, 1993; Aparicio y Guisande, agitación en una solución acuosa al 21% de
1997). Na0C1 tomada de una solución de lejía
En la actualidad, se presta gran atención a comercial. Finalmente las semillas fueron
la aplicación del cultivo in vitro para conservar lavadas tres veces con agua destilada
especies valiosas o en peligro de extinción esterilizada.
(Bramwell, 1990; Fay, 1992, Arregui et al. Antes de proceder a la inoculación de las
1993 y sus citas; Zdrate et al. 1997). La semillas en medio de cultivo, éstas se
situación tan crítica en que se encuentra E. escarificaron practicando con un bisturí un
algibicum nos ha hecho ensayar su propagación corte superficial (2-3mm.) a la testa en la parte
mediante técnicas de cultivo in vitro (Yeoman, opuesta a la ocupada por la radícula del
1986). Mediante el uso de estas técnicas se han embrión. Las semillas escarificadas (n=96)
obtenido resultados interesantes en diversos fueron cultivadas en tubos de ensayo
taxones de plantas amenazadas, residiendo una (I 50x25mm) conteniendo un medio nutritivo
parte importante del éxito en la puesta a punto estéril que incluía los elementos minerales y
de las técnicas, especialmente en grupos de vitaminas del medio de Murashige y Skoog
plantas con los que no se ha trabajado (1962) a mitad de concentración ( I /2MS),
previamente (Bramwell, 1990, Clemente et al. conteniendo 3% sacarosa, y 1 mg 1 - ' BAP
1991). (bencilaminopurina) (ECH- I) o bien 2 mg 1-'
Echinosparium algibicum	 37
BAP (ECH-2), solidificados con 0,5% agar y Otro grupo de plantas enraizadas en el
pH = 5,7. Por su parte las semillas no medio R/3 (n=50) se sometieron en tubos de
escarificadas (n=48) se cultivaron en el medio ensayo a tratamientos con CO 2 para estimular
ECH-1. En estos medios, además de la la fotosíntesis y su madurez metabólica foliar
germinación de las semillas se consiguió la previo paso a suelo. La producción de CO, se
inducción y multiplicación de yemas consiguió mezclando 0,5-1,0 gr de carbon-ato
adventicias con el posterior desarrollo de cálcico con 1-2 ml de una solución de HCI IN.
brotes. Los tubos de ensayo, sin tapas, conteniendo las
plantas enraizadas se colocaron en un recipiente
b) Enraizamiento cubierto con una bolsa plástica para así
Para el enraizamiento de los brotes mantener la atmósfera de CO 2 producida,
aislados se utilizó el mismo medio nutritivo repitiéndose esta práctica tres veces en tres
pero sustituyendo la citoquinina (BAP) por días consecutivos.
auxina (A1B) a una concentración de 0.2 mg Por otro lado, para estudiar el posible
1 1 (medio R13). Los brotes producidos en los efecto de la micorrización en la supervivencia
medios ECH-1 y ECH-2 (aprox. 600) fueron de las plantas micropropagadas (n=72), al
aislados y transferidos asépticamente a este substrato arriba descrito se le aplicó, en el
medio manteniéndose en el mismo durante momento de la colocación en vaso, una
aproximadamente 30-35 días. cucharada de inoculo conteniendo la micorriza
Una vez conseguida la inducción de raíces, (Glontus deserticola), arena, además de restos
40 plántulas fueron transferidas al medio 1/2 de raíces de avena.
MS conteniendo 1,5% de sacarosa (mitad de la Posteriormente, los vasos con el substrato
concentración usada comúnmente), carente de y las plantas se cubrieron con bolsas de plástico
reguladores de crecimiento, cultivándose en transparentes para mantener una atmósfera
este medio por 35-40 días previo paso a suelo. húmeda, colocándose luego en el invernadero.
Las demás plantas enraizadas se transfirieron Después de 3-4 días se practicó un corte en una
posteriormente a suelo. de las esquinas de la bolsa para permitir cl
Los cultivos se incubaron a 25 ± 2°C y contacto con el medio atmosférico, y así reducir
fotoperíodo de 16:8 h (luz/oscuridad). La paulatinamente la alta humedad. El segundo
i I uminación se consiguió con tubos corte a la otra esquina se realizó a los 6-7 días,
fluorescentes (Cool White) que proporcionaron y a los 9-10 días se procedió a la eliminación
una radiación de 30 pinol nr 2 de la bolsa, quedando las plantas directamente
en contacto con el medio ambiente.
c) Aclimatación a condiciones de suelo y Para determinar la existencia de
tratamiento con micorrizas micorrizas tras 18 días en suelo, se tomaron
Un grupo de plantas enraizadas (n=94), muestras de raíces de plantas cultivadas en
tanto en el medio conteniendo auxinas (R/3), substrato con y sin la adición de micorrizas.
corno provenientes del medio (1/2 MS; 1,5% Debido al efecto destructivo de la toma de
sacarosa) posterior al tratamiento auxínico, se raíces, ésta se practicó sólo con dos individuos
colocaron, tras eliminar el agar de sus raíces en de cada tratamiento.
contenedores plásticos (330 ml) conteniendo El método seguido fue una variación del
suelo arenoso de la localidad original en el descrito por Phillips y Hayman (1970). Las
Parque, al que se le añadió en ciertos casos raíces fueron lavadas con agua del grifo y
(n=80) turba comercial en la proporción 2:1 posteriormente sumergidas en una solución al
(suelo-turba). 10% de KOH calentada a 121°C y presión de
38	 R. Zárate et al.
0,1 MPa. durante 15 min. Tras ser enjuagadas cotiledones y la primera hoja vegetativa. Esta
tres veces con agua destilada y una final con inducción se observó tanto en la superficie de
0.1N HC1, las raíces fueron teñidas con 0,05% los cotiledones, como en los epicotilos y en la
(ply) azul de tripán en lactoglicerol durante 10 yema apical originariamente producida. Tras
min. Seguidamente, éstas se sumergieron en 45 días de cultivo en los medios ECH- I y ECH-
una solución acuosa al 50% de Et0H hasta que 2 se produjo un número medio de yemas
fueron montadas en un porta y observadas bajo desarrolladas por plántula de 8,5 y 6,9
un microscopio óptico. respectivamente, aunque no existió diferencia
significativa. No obstante, el número de
plantulas que indujeron yemas axilares fue
RESULTADOS estadísticamente mayor en el medio ECH- I
que EC1-I-2 (tab. 1). Además el desarrollo de
a) Germinación de semillas, inducción y callos y en algunos casos vitrificación, fueron
desarrollo de yemas adventicias más intensos en las plántulas germinadas y
Los resultados presentados en la figura 1 crecidas en el medio ECH-2.
muestran los porcentajes de germinación de
las semillas de E. algibicum en diferentes b) Enraizamiento de brotes
medios de cultivo y también en relación a la El enraizamiento de los brotes aislados de
escarificación o no de las mismas. Se observa E. algibicum, originados en los medios ECH-1
que la germinación fue significativamente y ECH-2, se consiguió en el medio R13. La
mayor para las semillas que habían sido emisión de las primeras raíces se observó para
escarificadas (ca. 100%), observándose además algunos brotes después de 10-12 días en este
que la citoquinina presente en los medios de medio, aunque la emisión fue manifiestamente
cultivo utilizados (ECH-1 y ECH-2) no influyó más clara después de 25-30 días, alcanzándose
en la germinación ya que se consiguieron entonces porcentajes medios de enraizamiento
porcentajes estadísticamente similares en de 35,49%, independientemente del medio
ambos medios (análisis Chi-cuadrado). inicial en el que se originaron los brotes.
La inducción de yemas adventicias ocurrió También en algunos casos se observó en la
8-12 días después de la germinación, cuando base de los brotes en contacto con este medio
las plántulas producidas habían emitido los nutritivo la aparición de callo.
	
Medios de cultivo	 Porcentaje de plántulas en donde se Número medio de yemas adventicias
	
indujeron yemas adventicias (n=96) por plántu la (n=96)
	 	
ECU -1 71,15' 8,6± 1,65'
	
ECH-2 42,16 B 	6,9 ± 2,14"
Tabla Inducción de yemas adventicias en plántulas de Echinospartum algibicum en diferentes medios de
cultivo después de 35-40 días desde el inicio del experimento. El número de plantas por tratamiento se
indica entre paréntesis. Análisis estadístico x 2 = 7,417, grado sign. 6,45x10-3 (Indices en letra mayúscula)
y test de Tuckey F prob. 0,5579 (Indices en letras minúsculas). Adventitious bud induction on Echinospartum
algibicum plantlets cultured on different nutrient media after 35-40 days from the initiation of the
experiment. The number of plants per treatment is indicated in brackets. Statistical analysis = 7,417,
sign. level 6,45x10-3 (upper case) and Tuckyey's test E prob. 0,5579 (lower case).
	
Echinospartum algibicum 	 39
c) Aclimatación y micorrizas infección ocurrió en las raíces de plantas
Los resultados de la aclimatación de E. cultivadas en los distintos substratos a los que
algibicum a suelo después de 60 días se se le añadió micorrizas (suelo+turba+
muestran en la tabla 2. Se observa que las micorriza; suelo+micorriza), incluso en las
plantas transferidas directamente del medio R/ raíces de plantas cultivadas en substrato sin
3 a suelo muestran los porcentajes más bajos micorriza (suelo+turba), indicando que la turba
de supervivencia, 10,0% y 6,40%, para suelo y/o el suelo empleados también parecen poseer
con y sin micorriza respectivamente y no micorrizas infectivas. No obstante, es necesario
presentaron diferencia estadística (x 2 0,79, mencionar que aquellas raíces de plantas de E.
nivel sign. 0,374). El porcentaje de algibicum procedentes de substratos a los que
supervivencia de las plantas provenientes del se les añadió el inoculo de micorrizas,
medio 1/2MS, 1,5% sacarosa, fue similar para presentaron un mayor número de hifas y
las que contenían la preparación micorrízica vesículas micorríticas. Sin embargo, los datos
(23,8%) en relación a los controles (18,0%) (x 2 de la supervivencia comparables para estos
0,804, nivel sign. 0,369). En cuanto a las plantas substratos con y sin micorrizas (medios R/3 y
que fueron sometidas a los tratamientos con I /2MS 1,5% sacarosa) (tab. 2) no mostraron
CO,, estas muestran unos porcentajes de diferencias estadísticamente significativas,
supervivencia estadísticamente diferentes con aunque este porcentaje fue mayor en los
respecto a los otros dos tratamientos (R/3 y 1/ substratos a los que se les añadió micorrizas.
2MS 1,5% sacarosa) (x 2 24,89, nivel sign.
6,04x10 -7 y c2 4,704, nivel sign. 0,030) (tab.
2). Por otro lado, no se presentó diferencia DISCUSIÓN
estadística en las plantas tratadas con CO 2 , que
fueron cultivadas en suelo y micorrizas con o La escarificación de las semillas supuso
sin turba (x 2 0,502, nivel sign. 0,478). un incremento en la tasa de germinación desde
La [Melón con azul de tripán mostró la aproximadamente 38% hasta casi 100%, lo que
presencia de hifas y vesículas teñidas de color parece señalar que la testa ejerce un claro
azul en las raíces de E. algibicum. Esta efecto mecánico inhibidor en la germinación.
	
Tratamiento Porcentaje de supervivencia
Tipos de suelo
	
Suelo+Turba+Micorriza Suelo+Micorriza Suelo+Turba
R/3 10,00 % (10 ) ^ 6,40% (10)''
1/2 MS, 1,5% sacarosa 23,80% (12)" 18,00 % (12)'
R/3 + CO, 41,30 % (36)c A 48,00 (14)A
Tabla 2. Porcentajes de supervivencia de plantas de Echinospartum algibicum tras su aclimatación a suelo
después de 60 días. El número de plantas por tratamiento se indica entre paréntesis. Los valores entre
columnas o filas no seguidos de la misma letra (mayúsculas columnas, minúsculas filas) difieren
significativamente mediante el test de x 2 (grado lib. l). Survival percentage of Echinospartum algibicum
plants following aclimatization to soil after 60 days. The number of plants per treatment is indicated in
brackets. Values within a column or a row not followed by the same letter (upper case columns, lower case
rows) differ significantly by x 1 test analysis (d.f. I).
40	 R. Zárate et al.
100 re responden al tratamiento si la BAP Sc aplicauna vez desarrolladas las plantulas en medio
93 nutritivo base.
/ A pesar de que el porcentaje medio deenraizamiento de brotes fue relativamente bajo,60 el medio R 13 fue el que produjo mejores
resultados (35,49%). El incremento en la
40 cantidad de AIB (> 0,2 mg 1 1 ) produjo peores
resultados; de la misma manera el uso de la
S,
.::../ auxina ANA provocó una mayor formación de23
callos que pareció inhibir el enraizamiento
,..0
w.... ?,. / 4 ://Y/ (datos no mostrados). También se empleóe ,
medio ECH- 1	 necio ECH-1	 molo ECH -2 tiamina (0,8 g en el medio de enraizamiento,
Serri II as intactas Serri II as e3carif icadas observándose un pobre desarrollo de las partes
aéreas (dato no mostrado), resultado opuesto a
Figura I. Porcentaje de germinación de semillas de Chee (1995) quien indicó que la tiamina
Echinospartum algibicum en difere=ntes medios de provocaba la estimulación del enraizamiento ycultivo tras ser o no= escarificadas (x  = 24,34; gradosign. 8,03x 10-7 y x  = 26,62; grado sign. 2,47x l posterior desarrollo de plantas, también
Germination percentage of Echinospartum leñosas, del género Taxus.
algibicum seeds on different growth inedia before La aclimatación de plantas a suelo es el
and after scariefic ation	 = 24,34; sign. level8,03x10-7 and = 26,62; sign. level 2,47x10-7). estadio final en los protocolos de
micropropagación, y este es especialmente
Este resultado confirma los obtenidos por delicado en plantas leñosas. Diversos autores
Aparicio (1993) y Aparicio y Guisande (1997), (Scott, 1986; Pennell, 1987) han indicado la
en los que un efecto mecánico inhibidor de la transcendencia que tratamientos preliminares,
testa de semillas de E. algibicum fue también como por ejemplo la composición del medio de
señalado, al igual que sucede en muchas otras cultivo o el medio ambiente que rodea a las
leguminosas. plantas, tienen para la aclimatación de las
La germinación de semillas escarificadas plantas producidas in vitro.
en medio carente de citoquinina también tuvo En este estudio, la baja tasa de
lugar originando porcentajes similares (datos supervivencia en la aclimatación registrada
no mostrados), lo que indica que la presencia con las plantas enraizadas procedentes del
de BAP no afecta a la germinación. No obstante, medio R/3 puede deberse al exceso de humedad
la transferencia posterior de estas plantulas a al mantener las bolsas plásticas por un período
los medios conteniendo citoquinina para la excesivamente largo, lo que pudo originar una
multiplicación de yemas (ECH- I y ECH-2), no infección fúngica que causó la muerte de
provocó ninguna respuesta. Este resultado muchos de los plantas. El tiempo en el que
confirma el publicado por Hussey (1986), donde posteriormente se mantuvieron las plantas en
se indica la importancia del tiempo de la toma suelo cubiertas con bolsas se redujo
de explantos en un momento apropiado de su ostensiblemente. Este acortamiento de 16-18
estadio de desarrollo para conseguir respuesta. días a 8-9 días aumentó claramente la
Aquí se observa que las plántulas de E. supervivencia de las plantas.
algibicum son sensibles y responden al El tratamiento con CO 2 incrementó el
tratamiento con citoquinina (BAP), si éste se número de plantas aclimatadas a suelo después
utiliza corno medio de germinación pero no de 60 días en los sustratos utilizados (tab. 2).
Echinospartum algibicum	 41
El CO, se aplica para 'despertar' la madurez algibicum. La mayor infección (mayor número
foliar de las plantas producidas in vitro, pues de hilas y vesículas por raíz y planta) de
es conocido que debido a las condiciones de aquellas plantas a las que se le añadió la
alta humedad y presencia de sacarosa en el preparación de micorrizas pudie:a explicar que
medio de cultivo, los mecanismos fotosintético en algunos casos el porcentaje de supervivencia
y estomático no funcionan o están mínimamente fuera mayor, coincidiendo con Tremblay et al.
activos, así como la carencia de ceras y cutícula (1986) quienes describieron el uso de simbiosis
foliares (Stafford, 1991). Sc observó un claro micorrízica para el paso a suelo de plantas del
incremento en la supervivencia para las plantas genero Mnus, lo que produjo un incremento en
tratadas con CO, (tab. 2) indicándose la el número de plantas aclimatadas comparado
efectividad de este tratamiento para la posterior con las no micorrizadas.
aclimatación de plantas de E. algibicum a suelo. En cl presente trabajo, el primero que se
Sin embargo, los porcentages de supervivencia desarrolla con plantas del género
en algunos casos fueron bajos y parecieron Echinospartum y que probablemente representa
disminuir a su vez con el tiempo de uno de los escasos trabajos en Genisteas, se ha
aclimatación. Un resultado similar fue descrito iniciado con éxito la puesta a punto para la
por Aparicio y Guisande (1997), donde plantas propagación de la especie, aunque las fases de
de E. algibicum obtenidas tras la germinación enraizamiento y, sobre todo, la supervivencia
tanto de semillas jóvenes como de semillas posterior de las plantas, no han arrojado aún
presuntamente con más de 20 años procedentes los resultados deseables. No obstante, en otras
del banco de semillas de suelo y cultivadas en especies amenazadas, como Cistus
suelo tomado de la población natural, no heterophyllus, esta técnica ha resultado muy
sobrevivieron después de un período de 20 exitosa (Arregui et al. 1993), por lo que deben
semanas, a pesar de los altos porcentajes de continuar los estudios en esta línea que junto
germinación. Estos autores plantearon la con el conocimiento de la biología, ecología y
posibilidad de que el bajo número de plantas estructura de la población puedan garantizar el
que fructifican en la actualidad pueda causar conocimiento de la misma y su total
pérdida de viabilidad y 'fitness' de los conservación y regeneración.
embriones producidos. No obstante, las plantas
en cultivo no siempre se comportan como en la
naturaleza y condiciones subóptimas de cultivo BIBLIOGRAFÍA
o problemas ecofisiológicos podrían también
APARICIO, A. -1993- Planes de Recuperación de
ser la causa de estos resultados. Sin embargo, especies vegetales amenazadas en el Parque
los resultados alcanzados animan a la Natural de la sierra de Grazalcma (Cádiz-
propagación de esta especie amenazada Málaga). Acta Bot, Malacitana 18: 199-221.
empleando estas técnicas. APARICIO, A. y R. GUISANDE -1995- Ecología y
El uso de la micorriza G. deserticola, no conservación de Echinospartum algibicum
produjo un incremento significativo en la Talavera & Aparicio (Genisteae, Fabaceae).
aclimatación (tab. 2). Tras 18 días, las plantas Acta Bol. Malacitana 20: 298-301.
aclimatadas en suelo sin la adición de esta APARICIO A. & R. GUISANDE -1997- Replenishment
of the endangered Echinospartum algibicum
micorriza aparecieron también positivas a la
(Genisteae, Fabaceae) from the soil seed bank.
tinción con azul de tripan, por lo que parecen Biological Conservation 79: 267-273.
también existir en la turba o en el suelo de la APARICIO, A. y S. SILVESTRE -1987- Flora del
población natural utilizados, ya que Parque Natural de la Sierra de Grazalema.
positivamente infestaron a las plantas de E. Agencia de Medio Ambiente, Sevilla.
42	 R. Zárate et al.
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Universidad de Nottingham School of Universidad de Sevilla, C/ Prof. García González s/
Agriculture. n 41012, Sevilla.