RT Book, Section
T1 Quantification of Virion-Sense and Complementary-Sense DNA Strands of Circular Single-Stranded DNA Viruses
A1 Rodríguez-Negrete, Edgar A.
A1 Grande-Pérez, Ana
A2 Fontes, Elizabeth P. B.
A2 Mäkinen, Kristiina
K1 Virus fitopatógenos - Aspectos moleculares
K1 Virus con ADN
AB Los virus de ADN monocatenario circular (ssDNA) están ampliamente distribuidos en procariotas y eucariotas, y su caracterización es esencial para comprender sus interacciones con los hospedadores. Este capítulo presenta un método sensible, rápido y específico para cuantificar las hebras en el sentido del virión (VS) y en el antisentido o complementario (CS) generadas durante la infección por virus ssDNA circulares, incluidos geminivirus como TYLCSV y TYLCV. El protocolo consta de una qPCR en dos pasos: primero, una copia única y específica de cada hebra mediante un cebador específico de cadena etiquetado y la ADN polimerasa T4, sin actividad de desplazamiento de hebra; después, la eliminación del cebador y la cuantificación por qPCR usando un cebador de etiqueta y uno específico. El método permite la cuantificación absoluta usando curvas estándar generadas con ssDNA o dsDNA circulares. Su aplicación en infecciones de tomate y Nicotiana benthamiana reveló diferencias en las relaciones VS/CS entre virus y hospedadores, y mostró que la mayoría de moléculas CS derivan de intermediarios de replicación de doble cadena. Esta técnica facilita el análisis detallado del proceso replicativo y de la dinámica de infección de virus ssDNA circulares.
AB Circular single-stranded DNA (ssDNA) viruses are widespread in both prokaryotes and eukaryotes, and analyzing their replication dynamics is essential for understanding virus–host interactions. This chapter describes a rapid, sensitive, and strand-specific method for quantifying virion-sense (VS) and complementary-sense (CS) DNA strands produced during infection by circular ssDNA viruses, including geminiviruses such as TYLCSV and TYLCV. The protocol involves a two-step qPCR: a first step in which a single copy of each strand is synthesized using a tagged strand-specific primer and T4 DNA polymerase lacking strand-displacement activity, followed by removal of unincorporated primers and a second qPCR step using a tag primer and a specific primer. Absolute quantification is achieved using standard curves generated from circular ssDNA or dsDNA. Application of this method to tomato and Nicotiana benthamiana infections revealed differences in VS/CS ratios between viruses and hosts and showed that most CS molecules derive from double-stranded replicative intermediates. This approach enables detailed examination of replication dynamics in circular ssDNA viruses.
PB Springer Nature
YR 2024
FD 2024
LK https://hdl.handle.net/10630/41074
UL https://hdl.handle.net/10630/41074
LA eng
NO 2024. En E. P. B. Fontes & K. Mäkinen (eds.), Plant–Virus Interactions, Methods in Molecular Biology, Vol. 2724, pp. 93–109. Springer Nature, New York.
NO This is an Author Accepted Manuscript version of the following chapter:Rodríguez-Negrete, E. A., & Grande-Pérez, A., “Quantification of Virion-Sense and Complementary-Sense DNA Strands of Circular Single-Stranded DNA Viruses”, published in Plant–Virus Interactions, edited by E. P. B. Fontes & K. Mäkinen, 2024, Springer Nature. Reproduced with permission of Springer Nature. The final authenticated version is available online at: https://doi.org/10.1007/978-1-0716-3485-1_8
NO https://www.springernature.com/gp/open-science/policies/book-policies
NO Programa Operativo FEDER 2014–2020
NO Consejería de Economía y Conocimiento, Junta de Andalucía
DS RIUMA. Repositorio Institucional de la Universidad de Málaga
RD 20 ene 2026