Análisis funcional de las asparraginasas de pino (Pinus pinaster Aiton) - Van Kerckhoven, Sonia Helena (UMA Editorial, 2017)
La asparragina es un metabolito clave en plantas para el transporte y reserva temporal de nitrógeno y la principal vía de movilización del nitrógeno, contenido en el grupo amido de este aminoácido, implica a la enzima asparraginasa (ASPG, EC 3.5.1.1) (Lea et al., 2007). Las ASPG de plantas pertenecen a la superfamilia NTN-hidrolasas (Michalska and Jaskólski, 2006), que se sintetizan como precursores inmaduros y se activan mediante un procesamiento que genera dos subunidades (α y β) y la exposición de un residuo nucleofílico al extremo amino de la subunidad β (Michalska et al., 2008). Existen dos subgrupos de ASPG en plantas, dependiente o independiente del ion potasio, y proteínas recombinantes de plantas angiospermas, expresadas en E. coli, muestran la capacidad de autoprocesamiento espontáneo in vitro (Bruneau et al. 2006). Sin embargo, una ASPG de Pinus sylvestris no presentó esta capacidad autoproteolítica, aunque se observó su activación cuando se le añadieron extractos de radículas de pino (Cañas et al., 2007). La estructura primaria de las ASPG de plantas presenta mucha variabilidad, tanto en secuencia como en longitud, en una región al extremo carboxilo de la subunidad α, a la cual se refiere como “región variable”. Esta región variable es especialmente extensa en la ASPG de P. sylvestris. Por lo tanto, existe la posibilidad de que en pino el precursor requiera algún factor externo para su procesamiento y posiblemente la extensa región variable, no conservada en enzimas ortólogas de especies angiospermas, participa en el proceso de activación. La mayoría de los estudios se han realizado en plántulas herbáceas anuales, mientras que en plantas leñosas perennes son muy limitados, y no se ha publicado ningún trabajo que caracterice en detalle una asparraginasa de gimnosperma.
Dado que el desarrollo del xilema secundario de leñosas es un importante sumidero de nitrógeno (Cantón et al., 2005) y que la disponibilidad de nitrógeno puede ser un factor determinante de la producción y cualidad de la madera de árboles (Novaes et al., 2009), consideramos que la actividad del gen ASPG podría ser de gran relevancia en este proceso. Objetivos Como objetivos se plantearon la identificación de proteínas con actividad ASPG en el pino con la ayuda del transcriptoma disponible, una caracterización básica que permite deducir su función en plántulas y una caracterización bioquímica más detallada de las que tengan mayor relevancia en la movilización de N, además de un análisis transcripcional de los correspondientes genes. Desarrollo teórico Una búsqueda en el transcriptoma disponible del pino nos permitió identificar secuencias codificantes para asparraginasas y se aislaron los correspondientes cDNA de longitud completa. Debido a los bajos niveles de la proteína en pino, la caracterización de las ASPG se abordó mediante la expresión de proteínas recombinantes en un sistema heterólogo in planta mediante agroinfección de hojas de Nicotiana benthamiana. Con el objetivo de determinar un posible papel para la extensa región variable, se eliminaron fragmentos progresivamente más grandes de su secuencia para comparar la capacidad de maduración de las proteínas mutantes in planta y determinar un posible efecto sobre las características bioquímicas. En paralelo se aplicó el sistema heterólogo de E. coli para estudiar la capacidad autocatalítica de los precursores recombinantes, recuperados de los cuerpos de inclusión, in vitro. El estudio de la regulación transcripcional de las ASPG se abordó por un lado mediante el análisis de la región promotora de una ASPG de pino, y por otro lado, mediante la técnica de PCR cuantitativa a tiempo real que proporcionó más información sobre la función de las ASPG de pino durante el desarrollo y crecimiento de los diferentes órganos de la plántula. Conclusiones En el transcriptoma del pino identificamos un total de tres mRNA diferentes cuyas secuencias codifican para asparraginasas. Las tres enzimas presentan una doble actividad asparraginasa/isoaspartilo dipeptidasa pero difieren en su especificidad de sustrato: PpASPG1 presenta una preferencia por L-asparragina como sustrato, mientras que PpASPG3 utiliza preferentemente β-Asp-Ala y PpASPG2 no mostró una preferencia particular por ninguno de los dos sustratos. Las características enzimáticas y el perfil de expresión apuntan al gen PpASPG1 como la forma principalmente implicada en la provisión de amonio y aspartato a partir de asparragina, para responder a las necesidades metabólicas requeridas por procesos de desarrollo o en respuesta a factores externos. La región variable de PpASPG1, que incluye un total de 77 aminoácidos al extremo carboxilo de la subunidad α, parece ser determinante de la preferencia de sustrato y además contribuir a la estabilidad de la enzima frente a la temperatura. Esta secuencia además influye positivamente en la eficiencia del proceso de maduración in planta pero impide la capacidad autocatalítica del precursor in vitro, por lo que podría formar parte de un mecanismo de regulación postraduccional en el pino, en el que estarían implicados otros factores desconocidos. El ion potasio tiene un efecto termoprotector sobre PpASPG1 pero su efecto activador es más limitado de lo que se ha descrito para las asparraginasas ortólogas en especies angiospermas, pudiendo el aumento en la actividad ser resultado de una mayor estabilidad de la enzima. La región promotora proximal del gen PpASPG1 contiene elementos identificados in silico como cajas cis relacionadas con regulación de la transcripción en respuesta a varios factores de estrés, para cuales se han confirmado experimentalmente que afectan a los niveles de transcritos del gen. Entre pinos de 11 procedencias diferentes, esta región promotora proximal presenta una variabilidad intraespecífica que afecta a posibles elementos cis de regulación transcripcional y podría contribuir, junto con variaciones observadas en la región distal, a diferencias en las respuestas a diversos factores externos.
Keywords: Pinos - Tesis doctorales; Asparragina; Nitrógeno; Coníferas; Pino; Procesamiento