Detection and characterization of mango malformation and its causal agent in Spain - Crespo Palomo, María (Universidad de Málaga, Servicio de Publicaciones y Divulgación Científica, 2014)
El mango (Mangifera indica L.) es un árbol originario de la región indobirmana, laderas del Himalaya y Sri Lanka, donde aún existen poblaciones silvestres y ha sido cultivado desde la antigüedad en la India como atestiguan las sagradas escrituras hindúes, los libros de los Vedas, redactadas entre el 1500 y el 1000 a. C. (Galán-Saúco, 2009). La dispersión del mango fue muy rápida por el subcontinente de la India y el archipiélago malayo con la apertura del comercio entre Asia y Europa. El mango llegó a África Oriental por viajeros árabes y fenicios, y los españoles lo introdujeron desde Filipinas a los puertos comerciales del continente americano hacia el siglo XVII. Los portugueses llevaron el mango al sur de África en el siglo XVI y a Brasil en 1700 (Galán-Saúco, 2009). Hacia la segunda mitad del siglo XVIII aproximadamente, el mango fue introducido en la Península desde las Islas Canarias. A finales del siglo pasado, el cultivo del mango comenzó a extenderse comercialmente por Andalucía oriental, fundamentalmente en las costas de Málaga y Granada. En España, su tasa de plantación está siendo relativamente rápida debido a la oportunidad comercial de este fruto en Europa (Ferrer, 1992). La distribución del cultivo del mango es amplia, abarcando países tropicales y subtropicales tanto del hemisferio Norte como del hemisferio Sur. Los principales países productores a nivel mundial son India, China, Indonesia, y Méjico. En España las principales variedades cultivadas son Osteen, Keitt, Kent y Tommy Atkins apareciendo otras variedades en menor medida. En la península Ibérica, las primeras fincas comerciales de mango se inician alrededor del año 1985 y se localizan principalmente en la zona de la Axarquía (Málaga). En la actualidad se estima que existen 3.500 ha plantadas. En los últimos años, el ritmo de plantación ha sido de 350-400 ha por año. Datos de ASAJA (Asociación agraria de jóvenes agricultores) en 2010 revelaron que en la zona de la Axarquía ese año se produjeron más de 11000 toneladas de mango con una facturación de 13 millones de euros (Gutiérrez-Barranquero, 2012). Desde el punto de vista económico y comercial, este cultivo podría enfrentarse a graves problemas derivados del monocultivo de la principal variedad, Osteen; que constituye el 80% de la superficie total de cultivo (Díaz-Robledo & Hermoso, 2009). Actualmente, la situación de este cultivo está cambiando, y se está apostando en mayor medida por la diversificación de las variedades cultivadas. El mango es la especie de mayor importancia agronómica de la familia de las Anacardiáceas tanto por su amplia distribución geográfica como por el valor económico de su fruto (Galán-Saúco, 2009). La propagación se suele realizar mediante varios métodos de injerto, desde el tradicional sistema de injerto por aproximación utilizado en la India desde tiempo inmemorial hasta diversos tipos de injerto de yema o púa. Las enfermedades o plagas que lo afectan se encuentran determinadas por las condiciones de cultivo, su localización geográfica, y la idiosincrasia del cultivar. Entre las plagas más importantes que atacan al mango se encuentran diversas especies de moscas de la fruta, cochinillas, trips y ácaros. Resaltar la importancia de la mosca de la fruta del Mediterráneo, Ceratitis capitata Wied. por su amplia distribución; y el taladrador de la semilla, encarnado por el coleóptero Sternochetus (=Cryptorhynchus) mangiferae (Fabricius), una plaga importante del mango cuya presencia limita la propagación de plantas en los viveros y cuyo control resulta complicado (Galán-Saúco, 1999). Una de las enfermedades más destructivas y difundidas es sin duda la antracnosis producida por Colletotrichum gloesporioides (Penz.) Penz. & Sacc., que ataca a hojas, inflorescencias y frutos. Se manifiesta con mayor intensidad en climas húmedos. Otra enfermedad de difusión mundial es el oídio, Oidium mangiferae Berthet, hongo que causa graves problemas si no se controla a tiempo, principalmente en la fase de floración y el cuajado del fruto. El oídio se ve favorecido por un ambiente seco y bajas temperaturas nocturnas (Torés, 1997). La necrosis apical del mango (NAM) es una enfermedad de difusión más restringida, que afecta a yemas, hojas, tallos e inflorescencias, llegando a ocasionar importantes pérdidas económicas en plantaciones, principalmente del área mediterránea (España, Portugal, Italia e Israel), o zonas con clima parecido (Australia) (Cazorla et al., 1998; Golzar & Cother, 2008). Los síntomas incluyen la necrosis de las yemas vegetativas y florales, pudiendo impedirse el desarrollo de las mismas como consecuencia de la necrosis. La bacteria causante de la enfermedad Pseudomonas syringae pv. syringae (Cazorla et al., 1998), se ve favorecida en períodos fríos y húmedos, jugando la lluvia o el rocío un importante papel en la diseminación del inóculo entre distintas partes del árbol y a árboles adyacentes. En nuestro grupo de investigación, también se ha descrito por primera vez la implicación de cepas patógenas de Pantoea agglomerans como agente causal de la NAM en las Islas Canarias (Gutiérrez-Barranquero et al., 2012a). El control de esta enfermedad en el campo es muy complejo, debido a la cantidad de factores que pueden estar involucrados en el desarrollo de los síntomas. Un tratamiento efectivo para esta enfermedad ha sido la aplicación de compuestos basados en el cobre, en particular el caldo bordelés (Cazorla et al., 2006); sin embargo, debido a los problemas de toxicidad y contaminación que estos productos pueden generar en el suelo, se desarrolló en nuestro grupo de investigación una alternativa más respetuosa con el medio ambiente en forma de gel de silicio, y que en la actualidad se utiliza ampliamente para controlar la NAM en fincas del sur de España (Gutiérrez-Barranquero et al., 2012b). Otra enfermedad bacteriana relevante es la producida por Xanthomonas campestris pv. mangiferaeindicae, denominada mancha negra bacteriana o mancha angular, por la aparición de manchas húmedas en hojas y fruto que ennegrecen rápidamente, así como chancros negros en tallos y tronco (Galán-Saúco, 2009). Hasta la fecha, esta enfermedad no ha sido detectada en el área mediterránea. 1.1 La malformación del mango La malformación es una de las enfermedades más importantes del mango en el mundo y causa importantes pérdidas económicas. La malformación fue observada por primera vez en la India en 1891 (Marasas et al., 2006) y en la actualidad se ha descrito en la mayoría de los países productores del mundo tales como Egipto, Sudáfrica, Sudán, Israel, Malasia, Omán, China, Pakistán, Bangladesh, Brasil, Méjico y EE.UU., entre otros (Marasas et al., 2006; Youssef et al., 2007; Kavas et al., 2008; Zhan et al., 2010; Kumar et al., 2011), y en el presente trabajo se ha descrito en España (Crespo et al., 2012). La malformación afecta tanto a brotes vegetativos como a brotes florales, dándose la primera sobre todo en plantas jóvenes y en plantas de vivero, especialmente cuando éstas se cultivan bajo árboles afectados, lo cual es una práctica común en Oriente Medio (Ploetz et al., 2001; Youssef et. al., 2007). En la malformación vegetativa la pérdida de dominancia apical conduce a que las yemas vegetativas axilares o apicales produzcan brotes deformes que muestran reducción de los entrenudos y de la lámina foliar (Kumar et al., 1993). La enfermedad limita el crecimiento de plantas jóvenes y puede conducir a la muerte de la planta en el caso de que todas las yemas se encuentren afectadas. El desarrollo de la malformación vegetativa en la mayor parte de las ramas en un árbol, conduce a una reducción considerable de la floración o a la ausencia total de ésta (Kumar & Beniwal, 1992). Generalmente, una rama que muestra síntomas de malformación vegetativa también produce inflorescencias malformadas (Singh et al., 1961). Además, la enfermedad debilita seriamente los plantones utilizados como portainjerto y compromete la seguridad del movimiento nacional e internacional de germoplasma (Ploetz, 2001). En cuanto a los síntomas de la malformación floral, los más característicos y comunes, las inflorescencias presentan una reducción en la longitud del eje primario y secundario, los cuales son más gruesos que los ejes normales, además pueden ser muy ramificados, presentando un aspecto de racimo. Las panículas malformadas producen un número de flores hasta tres veces superior al de las panículas normales, con una proporción mayor de flores masculinas que hermafroditas, y además pudiendo alcanzar éstas hasta el doble de su tamaño normal (Singh et al., 1961). Las inflorescencias afectadas, generalmente no producen fruto y cuando lo hacen los pierden prematuramente, lo que conlleva importantes pérdidas económicas. Además, las inflorescencias afectadas si no son retiradas constituyen una importante fuente de inóculo secundario y contribuyen a la dispersión de la enfermedad entre árboles cercanos. Esta enfermedad ha sido atribuida a varias especies de hongos del género Fusarium. Fusarium mangiferae y Fusarium sterilihyphosum fueron descritas en 2002 como especies asociadas con la malformación del mango, y en la actualidad se encuentran, una o ambas especies, en muchas zonas productoras del mundo, tanto del hemisferio Norte como del hemisferio Sur (Britz et al., 2002; Marasas et al., 2006; Youssef et al., 2007; Kvas et al., 2008; Lima et al., 2009b; Kumar et al., 2011), incluyendo el sur de España, como se describe en este trabajo (Crespo et al., 2012). Fusarium proliferatum, también ha sido descrita como causante de la malformación floral en Egipto, sur de China y Malasia (Haggag et al., 2009; Zhang et al., 2010; Nor et al., 2013). En Méjico, Fusarium mexicanum ha sido descrito como el principal agente causal de la enfermedad (Otero-Colina, 2010). Hasta la fecha, la última nueva especie descrita asociada a esta enfermedad ha sido Fusarium tupiense en Brasil y Senegal (Lima et al., 2012; Senghor et al., 2012), especie que también se ha detectado en el Sur de España en el presente trabajo. Estas especies se pueden diferenciar y caracterizar mediante el empleo de herramientas genéticas y moleculares que incluyen la determinación del grupo de compatibilidad vegetativa (VCG); polimorfismos de longitud de fragmentos de DNA amplificados (AFLPs) (Lima et al., 2009b) y polimorfismos de fragmentos de DNA amplificados al azar (RAPD-PCR), basados en la reacción en cadena de la polimerasa (PCR); la secuenciación parcial de genes "housekeeping" (O´Donnell et al., 1998, 2000; Steenkamp et al., 2000; Marasas et al., 2006; Lima et al., 2009b; Crespo et al., 2014), y la determinación del tipo sexual (mating-type) (Britz et al., 2000). Con el propósito de poder realizar un diagnóstico rápido y específico de algunas de las especies asociadas a la malformación, mediante PCR, Zheng y Ploetz (2002) desarrollaron una pareja de cebadores, 1-3F/R, que amplifican un fragmento específico de 608 pb incluido en las ITS de F. mangiferae, que permite el diagnóstico de esta especie. Un segundo par de cebadores, 61-2F/R, diseñados originalmente para el diagnóstico de Fusarium subglutinans aislado de maíz (Möller et al, 1999), que no amplifican el DNA de F. mangiferae, pero sí amplifican cuando los protocolos de amplificación se adecúan, un fragmento de 445 pb a partir de aislados de F. sterilihyphosum y F. mexicanum (Zheng y Ploetz, 2002; Rodriguez-Alvarado et al., 2007). Como se ha mencionado anteriormente, es posible caracterizar la diversidad poblacional de estas especies mediante el empleo de varias técnicas genéticas y moleculares. Conocer la diversidad de una población fúngica desconocida, en nuestro caso las especies de Fusarium patógenas de mango en España, puede resultar muy relevante para comprender aspectos sobre la introducción y la dispersión del patógeno en un área determinada, y por lo tanto desarrollar medidas de control más eficaces. La epidemiología de la malformación del mango no está aún clara, el patógeno parece transmitirse principalmente en el proceso de injerto y a través de material de vivero infectado, aunque restos de inflorescencias con malformación actúan como fuente de inóculo secundario. Los microconidios constituyen propágulos infecciosos ya que son el principal tipo de esporas producidas de manera profusa por el hongo en las panículas afectadas (los macroconidios son menos frecuentes). La dispersión dentro de las plantaciones es lenta debido a la rápida muerte de los conidios del hongo en el suelo, no obstante parece verse favorecida por determinados artrópodos que pueden actuar como vector del hongo como es el caso del ácaro Aceria mangiferae (Gamliel-Atinsky et al., 2009a). Aunque numerosos aspectos del patrón de colonización del hongo y de su ciclo de vida están aún por dilucidar, parece claro que las heridas facilitan la infección y el desarrollo posterior de la enfermedad (Gamliel-Atinsky et al., 2009c). Su control es muy difícil y tras la infección se produce un avance progresivo de la enfermedad hacia brotes sanos, desde brotes afectados e inflorescencias marchitas. La dispersión a pequeña escala es evidente en los viveros (Prakash & Srivastava, 1987), pero a mayores distancias la diseminación probablemente tiene lugar a través de material propagativo (Lima et al., 2009a). El empleo de diversos fungicidas se ha mostrado muy poco eficaz, y hasta el momento el método más adecuado es la eliminación manual de los brotes con síntomas y su destrucción, y el control eficaz del empleo de material propagativo sano (Cazorla et al., 2009; Freeman et al., 2014). 1.2 Detección y aislamiento de especies de Fusarium causantes de malformación del mango en la Axarquía (España) Nuestro objetivo en este trabajo ha sido confirmar la presencia de la malformación del mango en el Sur de España y conocer su distribución geográfica; identificar las especies de Fusarium asociadas a esta enfermedad en la región de la Axarquía y confirmar su patogenicidad. Analizar la diversidad de las poblaciones de Fusarium spp., y determinar las relaciones filogenéticas entre estos aislados y otros Fusarium spp. asociados con la malformación del mango a nivel mundial. Hasta 2006, los árboles de mango en España se consideraban libres de malformación, aunque desde hacía algunos años se venían observando de forma esporádica árboles con síntomas sospechosos de malformación en plantaciones de mango del sur de la península. La aparición de los primeros síntomas en la costa andaluza es difícil de precisar, pero es en la primavera de 2006 cuando se realizaron las primeras tomas de muestras en plantaciones comerciales de la Axarquía y fue entonces cuando se planteó la necesidad de abordar este trabajo, que tenía como finalidad confirmar la presencia de esta enfermedad en los cultivos de mango en la provincia de Málaga, concretamente en la Axarquía, y evaluar su incidencia y distribución espacial en la zona de estudio; así como determinar cuál o cuáles de sus posibles agentes causales estaban presentes en la Axarquía, la variabilidad de sus poblaciones, y proponer medidas preventivas de vigilancia y control de esta enfermedad. Para ello, en este estudio se llevaron a cabo prospecciones sistemáticas durante los años 2009-2012 en diferentes términos municipales de la Axarquía: Algarrobo, Almáchar, Benamargosa, Benamocarra, Cajiz, Cútar, Frigiliana y varias localidades de Vélez-Málaga, y coincidiendo con los meses de floración del mango, es decir, desde abril hasta julio aproximadamente, cuando los síntomas se hacen más evidentes. Se obtuvieron muestras en un total de 43 fincas con síntomas aparentes de malformación del mango; en 36 de las cuales se aisló Fusarium, y en trece de ellas se llevó a cabo un seguimiento durante varios años con el fin de evaluar la dispersión del patógeno, y la eficacia de las labores de saneamiento y control. 1.3 Identificación del agente/s causal/es de la malformación del mango en España Como resultado de estos muestreos, se obtuvo una colección de 127 aislados monospóricos de Fusarium spp. procedentes de muestras de tejidos de mango infectados, de 10 municipios diferentes de la Axarquía. A esta colección se añadieron los siete aislados previamente obtenidos en 2006. Para conocer la identidad del agente causal de la malformación del mango en el sur de España, se emplearon dos estrategias metodológicas complementarias, el estudio de las características micromorfológicas del hongo a microscopía óptica, y el empleo de técnicas de biología molecular basadas en el empleo de cebadores específicos de distintas especies de Fusarium y la reacción en cadena de la polimerasa (PCR). El examen detallado a microscopio óptico de aislados monospóricos cultivados en agar patata dextrosa (PDA) y agar hoja de clavel fresca (FCLA) permitió diferenciar dos grupos principales de aislados. Así, 40 aislados mostraron características morfológicas que concordaban con las descritas para F. mangiferae, es decir, micelio aéreo de coloración salmón-púrpura, conidióforos en forma de mono y polifiálides, macroconidios con tres a cinco septos, y abundantes microconidios en falsas cabezas; esporodoquios de color anaranjado en la superficie del agar y ausencia de clamidosporas. Esta identificación presuntiva fue comprobada mediante PCR, con el empleo del par de cebadores específicos 1-3F/R descritos para esta especie, descartándose los aislados UMAF F0602, UMAF F1043 y UMAF F1063, que aunque mostraban características fenotípicas muy similares a F. mangiferae, no amplificaron con el par de cebadores descritos para esta especie. Por otra parte, el aislado UMAF F0923 cuya morfología no coincidía con la descrita para F. mangiferae sí mostró amplificación con los cebadores específicos para esta especie, aunque con el análisis posterior de caracterización adicional (VCG, patogenicidad, análisis filogenético y el tipo de compatibilidad sexual), fue diagnosticado como F. mangiferae atípico al tratarse de un aislado con algunas características diferentes y no patogénico. El grupo mayoritario de aislados (90) mostraba algunas características morfológicas diferentes a las descritas para F. mangiferae, presentando así mismo mono y polifiálides, microconidios dispuestos en falsas cabezas y ausencia de clamidosporos, pero los macroconidios eran más cortos y anchos que aquellos producidos por los aislados de F. mangiferae, y además no se obtuvo amplificación con el par de cebadores específicos de F. mangiferae con ninguno de ellos. Sin embargo, sí se obtuvo amplificación con el par de cebadores 61-2F/R en estos 90 aislados y en los tres que morfológicamente eran más parecidos a F. mangiferae pero no fueron diagnosticados como tal (UMAF F0602, UMAF F1043 y UMAF F1063). Finalmente otros tres aislados (UMAF F0927, UMAF F0928 y UMAF F1062) mostraron morfologías no concordantes con ninguna de las descritas para las especies de Fusarium asociadas a la malformación del mango y no se obtuvo amplificación con ninguna de las dos parejas de cebadores. En total, se analizaron 134 aislados de Fusarium spp. que fueron identificados en dos especies principales, 38 aislados diagnosticados como F. mangiferae aunque entre éstos, el aislado UMAF F0923 presentaba características morfológicas atípicas y no era patogénico; 93 se diagnosticaron como F. tupiense, ya que aunque en la fase inicial del trabajo no se obtuvo una identificación concluyente, sí lo fueron mediante las técnicas genéticas y moleculares adicionales empleadas en esta tesis. Finalmente, otros tres aislados de Fusarium sp. no incluidos en ninguna de estas dos especies, dos de los cuales en análisis filogenéticos posteriores quedaban agrupados en un clúster próximos a Fusarium phyllophilum denominándose en este trabajo como F. phyllophilum- like. 1.4 Confirmación de la patogenicidad de los aislados de Fusarium de la Axarquía Llegados a este punto, era necesaria también la comprobación de la patogenicidad de dichos aislados mediante ensayos de inoculación de árboles sanos de mango, y en particular de los aislados no identificados de manera concluyente a nivel de especie. Las inoculaciones se llevaron a cabo en condiciones controladas en tres ensayos independientes que se iniciaron en marzo y noviembre de 2010 y noviembre de 2011. Como resultado de éstos ensayos de patogenicidad se comprobó de manera inequívoca la implicación en la producción de síntomas claros de malformación floral y/o vegetativa en árboles de mango, de siete aislados representativos de F. mangiferae, mientras que el aislado atípico UMAF F0923 resultó no patogénico. También se confirmó la implicación de los 12 aislados representativos de F. tupiense y del aislado de Fusarium phyllophilum-like (UMAF F0927) ensayados en la inducción de síntomas de la enfermedad, confirmándose así el papel de todos ellos como agentes causales de la misma en la zona de la Axarquía. El aislado de Fusarium sp. UMAF F1062 resultó no patogénico. Se comprobó que la totalidad de los aislados recuperados eran idénticos morfológicamente a aquellos inoculados, además el fragmento específico de 608 pb o de 445 pb se amplificó por PCR en todos los aislados con la excepción del aislado F. phyllophilum-like (UMAF F0927) como cabía esperar. 1.5 Estudio de la diversidad de las poblaciones de Fusarium patógenas de mango en la Axarquía El hecho de que se hayan aislado tres especies diferentes de Fusarium patógenas de mango en la Axarquía, indica claramente que la diversidad de las poblaciones de este hongo causantes de la malformación del mango en la Axarquía es elevada; por ello, nos planteamos profundizar en el estudio de la diversidad genética intraespecífica de las mismas, con la hipótesis de que la diversidad podía ser aún mayor, lo que pondría además de manifiesto la introducción de inóculo primario incluso en más ocasiones. Este estudio de la diversidad de las poblaciones del hongo se abordó empleando varios métodos experimentales. En primer lugar, se analizaron genotípicamente la práctica totalidad de los aislados (131) mediante las técnicas de apPCR y RAPD-PCR. El análisis de diversidad por las mencionadas técnicas se basa en la realización de reacciones de PCR utilizando cebadores arbitrarios, que permiten detectar variabilidad genética entre diferentes especies, así como intraespecífica. En este estudio de diversidad se han empleado cinco cebadores (GACAC)3, (GACA)4, (CAG)5, OPF-08 y OPF-13, y con todos ellos se han observado claras diferencias entre los perfiles de bandas de otras especies de Fusarium implicadas en la malformación del mango a nivel mundial, F. sterilihyphosum, F. mexicanum, F. tupiense. Los aislados de F. mangiferae encontradas en la Axarquía mostraron un perfil similar al del aislado de F. mangiferae de referencia MRC7560. En el caso de los aislados de F. mangiferae incluyendo 3 aislados de referencia de F. mangiferae aislados de Israel, Egipto y EE.UU., los cebadores (GACA)4, y OPF-13 permitieron además detectar diferencias intraespecíficas. Como resultado pudimos diferenciar genotípicamente dos poblaciones diferentes de F. mangiferae, el genotipo 1 formado por la mayor parte de los aislados, y el genotipo 2 constituido por solo 4 aislados de una misma finca, aunque aislados en años diferentes, y también por los aislados de Israel y Egipto (MRC7560 y EM50B). Sin embargo, los 92 aislados de F. tupiense de la Axarquía ensayados, con la única excepción del aislado UMAF F1182, mostraron un perfil de bandas homogéneo entre todos ellos con los cinco cebadores empleados, e idéntico a un aislado procedente de Brasil y perteneciente al VCG I usado como referencia (F. tupiense NRRL 53995). Respecto a los dos aislados de F. phyllophilum-like (UMAF F0927 y UMAF F0928) procedentes ambos de una misma finca, mostraron un perfil homogéneo entre sí y diferente de todos los demás aislados y cepas de referencia ensayados. Para profundizar aún más en este análisis de la diversidad genética de las poblaciones de Fusarium en la Axarquía se determinaron los grupos de compatibilidad vegetativa (VCG) entre aislados representativos de las tres especies. Los VCG en hongos se determinan para conocer la diversidad en las poblaciones fúngicas y son de enorme utilidad en estudios de epidemiología. Su determinación se basa en la compatibilidad miceliar (anastomosis de hifas) entre aislados diferentes del mismo VCG, lo que permite clasificar los aislados en distintos VCG (Puhalla, 1985). Cuando dos aislados complementan entre sí se dice que pertenecen al mismo VCG, y por lo tanto son genéticamente muy próximos. Para la clasificación de nuestros aislados de F. mangiferae se enfrentaron 33 aislados representativos (incluyendo el aislado UMAF F0923, no patogénico), entre sí y frente a una colección de aislados de F. mangiferae de referencia de los 6 VCG descritos por Zheng y Ploetz, (2002), y un aislado procedente de Israel, así como dos aislados de F. sterilihyphosum y dos aislados de F. mexicanum procedentes de diferentes colecciones. De igual forma se determinaron los VCG de 41 aislados representativos de F. tupiense junto a aislados de referencia de las especies antes mencionadas y una colección de 6 aislados de F. tupiense de referencia, uno por cada VCG descrito para esta especie (Lima et al., 2009a), y los dos aislados de F. phyllophilum-like. Con este experimento se ha conseguido confirmar que los aislados de la malformación del mango en la Axarquía se corresponden, en base a sus características genotípicas diferenciadas, con tres grupos homogéneos, como cabía esperar de especies diferentes. No obstante, se observa que los aislados de F. mangiferae se distribuyen a su vez en tres grupos de compatibilidad vegetativa, VCG 7 constituido por la mayoría de los aislados correspondientes al genotipo 1, y VCG 8 formado por los cuatro aislados procedentes de una misma finca y con genotipo 2, y un tercer VCG agrupando 4 aislados de la Axarquía también de genotipo 1, entre ellos el aislado UMAF F0923 con características morfológicas atípicas, y dos aislados de Sudáfrica en el VCG 5 descrito por Zheng y Ploetz, 2002; sugiriendo que esta especie se ha introducido en España al menos en tres ocasiones (Crespo et al., 2014). Además, se puso de manifiesto que los aislados de F. mangiferae de la Axarquía no se complementan con ninguno de los aislados de F. mangiferae procedentes de Egipto, EE.UU. e Israel, utilizados en el experimento, indicando que aunque son la misma especie, tienen un genotipo y origen diferenciados. En cuanto a los aislados de las otras dos especies, todos los aislados de F. tupiense ensayados mostraron pertenecer a un mismo VCG al igual que mostraron un genotipo homogéneo, sugiriendo que la población de F. tupiense en la Axarquía posiblemente sea una población clonal. Estos aislados han resultado pertenecer a uno de los VCG descritos para F. tupiense en Brasil (VCG I), lo que sugiere que ambas poblaciones podrían tener un origen común, y que la introducción en España probablemente se haya realizado a través de material infectado procedente de países donde está presente como Brasil o Senegal. Los dos aislados de F. phyllophilum-like como cabía esperar constituyeron un VCG separado de los demás. Para completar este estudio de diversidad de las poblaciones de Fusarium en la Axarquía, también se determinó el tipo de compatibilidad sexual (mating-type) que presenta cada uno de los aislados españoles. Este análisis resulta de crucial importancia a la hora de realizar cruzamientos entre aislados. El locus MAT determina el tipo sexual de los hongos y los genes MAT tienen el potencial de delimitar las fronteras entre especies (Yun et al., 2000) y su utilidad ha sido demostrada en análisis filogenéticos (Leslie & Klein, 1996). Los resultados obtenidos tras analizar 132 aislados de Fusarium procedentes de muestras de mango de la Axarquía indican que la mayoría de los mismos (117 aislados) son del tipo MAT-2, confirmando así que la reproducción de las especies de Fusarium detectadas en la Axarquía ocurre casi exclusivamente de forma asexual. No obstante, se han encontrado algunas excepciones, dos aislados del genotipo 1 de F. mangiferae (UMAF F12123 y UMAF F12126) son del tipo MAT-1, así como un único aislado de F. tupiense (UMAF F1168), lo que implica la evidencia de un nuevo elemento de diversidad en las poblaciones de la Axarquía. Por otra parte, con doce aislados no fue posible determinar el tipo de compatibilidad sexual. Con el objeto de profundizar en el diagnóstico de los aislados implicados en la malformación del mango en la Axarquía, así como para confirmar la identificación de los aislados de F. tupiense de la Axarquía se llevó a cabo también la secuenciación parcial de varios genes "housekeeping" de los mismos. La secuenciación de uno o más de estos genes conservados se suele realizar para asignar especie o para obtener información sobre las relaciones filogenéticas entre los aislados (Leslie & Summerell, 2006). Este análisis filogenético se realizó en dos ensayos independientes incluyendo un número representativo de aislados de la Axarquía, (29). En nuestro laboratorio se secuenciaron y compararon bioinformáticamente las secuencias parciales de los genes factor de elongación 1-alfa (TEF) y β-tubulina, de aislados representativos seleccionados teniendo en cuenta la máxima diversidad posible, 9 de F. mangiferae incluyendo el aislado UMAF F0923, 17 de F. tupiense y 2 F. phyllophilum-like, con secuencias equivalentes de otras cepas de diferentes especies incluidas en el complejo Gibberella fujikuroi (GFSC) y disponibles en el banco de genes del NCBI (GenBank) y en la base de datos de Fusarium (Fusarium-ID). El árbol filogenético resultante agrupó los aislados de F. mangiferae de la Axarquía con los otros aislados de F. mangiferae procedentes de Israel e India en el denominado clado asiático. Los aislados de F. tupiense españoles agruparon con los aislados de F. tupiense de Brasil en el clado americano, y los dos aislados de F. phyllophilum-like agruparon en un clúster próximo a Fusarium udum en el clado africano. Un segundo estudio filogenético más en profundidad se llevó a cabo mediante la secuenciación parcial de siete genes "housekeeping": factor de elongación 1-alfa (TEF), β-tubulina, calmodulina, histona H3, nuclear ribosomal intergenic spacer region (IGS rDNA), y dos subunidades de la RNA polimerasa (RPB y RPB2), en colaboración con el Bacterial and Foodborne Pathogen and Mycology Research Unit, U.S. Department of Agriculture-Agricultural Research Service (IL, EE.UU.). El análisis filogenético se llevó a cabo con varios aislados representativos españoles, dos aislados de F. mangiferae, cuatro de F. tupiense y uno de F. phyllophilum-like, y se incluyeron secuencias de varias especies de Fusarium implicadas en la malformación del mango junto con otras especies pertenecientes al GFSC. Los resultados obtenidos fueron similares, aunque, el aislado de F. phyllophilum-like agrupó también en el clado africano pero esta vez más próximo a F. phyllophilum que a F. udum; por esto en este trabajo se han denominado como F. phyllophilum-like. Con el objeto de determinar la fertilidad de los aislados de Fusarium de la Axarquía con tipos de compatibilidad sexual opuesta, y comprobar si los aislados de F. tupiense españoles podían cruzarse con aislados de Brasil, se realizaron diferentes ensayos de cruzamiento sexual. Por un lado entre aislados españoles de F. mangiferae, y por otro lado entre aislados de F. tupiense, incluyendo en este caso dos aislados de referencia de Brasil. La mayoría de los ascomicetes, incluyendo Fusarium son generalmente haploides y se pueden propagar de forma vegetativa o reproducirse de manera sexual. Con frecuencia, solo se conoce la forma asexuada del hongo (anamorfo), y la identificación del hongo se hace en base a las características de éste. La forma sexuada o perfecta (teleomorfo) es en muchos casos desconocida. Todas las especies de Fusarium estudiadas son heterotálicas, y un aislado puede servir como macho o como hembra, pero no puede fertilizarse a sí mismo por que se requieren diferentes tipos de compatibilidad sexual (MAT-1 y MAT-2) para que el cruzamiento tenga éxito. La capacidad de dos aislados para producir el teleomorfo constituye una prueba adicional y concluyente de que ambos aislados pertenecen a la misma especie (Leslie & Summerell, 2006). El estado perfecto de F. mangiferae aún no ha sido descrito por lo que no se dispone de aislados hembra fértiles de referencia para realizar los cruzamientos; sin embargo, en el caso de F. tupiense sí se dispone de estos aislados, ya que el estado perfecto de este hongo fue descrito por Lima et al., (2012). De esta forma, dos aislados brasileños de F. tupiense hembra fértiles (CLM1000 y CLM1843) se incluyeron en ensayos de cruzamiento con el ánimo de confirmar también por esta vía, la identidad de los aislados de F. tupiense de la Axarquía. A pesar de las reiteradas repeticiones experimentales, en ningún caso se consiguió obtener el estado perfecto en los cruzamientos realizados entre aislados de F. mangiferae de la Axarquía, ni en el caso de los cruzamientos entre aislados de F. tupiense de Brasil y España. Este resultado puede deberse a la baja fertilidad de los aislados de campo y/o a condiciones experimentales inadecuadas. A modo de resumen de los diferentes estudios sobre el diagnóstico y la diversidad de las poblaciones de Fusarium patógenas de mango en la Axarquía, podemos resaltar algunos aspectos. La población de Fusarium patógenos de mango en la Axarquía entre 2009 y 2012, consta de al menos tres especies diferentes: F. mangiferae, F. tupiense y F. phyllophilum-like, esta tercera especie restringida a una única finca y nunca antes descrita como patógena de mango. En cuanto a las dos especies mayoritarias, en el caso de F. mangiferae se han diferenciado claramente tres genotipos en base a los diferentes análisis de diversidad realizados, uno mayoritario y otros dos asociados a fincas concretas. Por el contrario, en el caso de F. tupiense aparentemente se trata de una población clonal homogénea, cuyo genotipo ha resultado similar a uno de los descritos para F. tupiense en Brasil. Si bien esta introducción pudo haber llegado procedente de Brasil también pudo haberlo hecho procedente de Senegal donde recientemente se ha detectado esta misma especie (Senghor et al., 2012). Desde el punto de vista epidemiológico nuestros estudios indican de forma concluyente que al menos se han producido cinco entradas diferentes de inóculo primario del patógeno en España, en todos los casos anteriores a 2009. Es evidente que el control sobre la entrada de material vegetal infectado no fue el adecuado, y se ha mostrado claramente insuficiente, como evidencian estos resultados, explicando de esta manera la reiterada llegada de esta enfermedad a España por diferentes vías. Ello nos hace llamar la atención sobre lo imprescindible de extremar el control sobre la importación de material vegetal, para evitar la entrada de nuevos inóculos. De las cinco entradas mencionadas, tres de ellas han quedado muy restringidas, aparentemente a una sola finca, o muy pocas, es el caso de F. phyllophilum-like y de F. mangiferae genotipo 2 y genotipo 1-VCG 5, con la circunstancia positiva adicional de que en los dos primeros casos en dichas fincas en 2012 ya no se han observado síntomas tras la aplicación reiterada de las medidas de saneamiento recomendadas. Por el contrario, los otros dos casos, F. mangiferae genotipo 1 (VCG 7) y F. tupiense han sufrido una importante diseminación por toda la región, que mientras en el primer caso ya parece haberse estabilizado, en el segundo caso parece continuar en expansión, siendo actualmente la especie predominante en la Axarquía. Asimismo, estos resultados también sugieren que una forma principal de diseminación de esta enfermedad en la región es el uso de material vegetal de propagación infectado, siendo por ello también muy importante extremar el cuidado en la selección de la planta madre de dónde se obtienen las púas de injerto, para evitar emplear plantas infectadas y asintomáticas y que con ello prosiga la diseminación de la enfermedad. Es evidente que para que una enfermedad que no estaba presente en una zona de cultivo aparezca en la misma es necesaria la introducción del patógeno mediante un inóculo primario. Esta introducción de inóculo primario, dado el aislamiento geográfico de la costa andaluza respecto a otras áreas de cultivo, se ha debido con mucha probabilidad a la importación de material infectado, y como se acaba de exponer, en base a los resultados de diversidad genética, este hecho se ha producido aparentemente en al menos cinco ocasiones. Una vez que el patógeno está presente en la zona de cultivo la transmisión de la enfermedad se facilita por medio de la dispersión del inóculo secundario por vías alternativas. Por tanto, podemos señalar tres aspectos críticos para controlar la difusión de la enfermedad en la Axarquía y que es imprescindible considerar: - Entrada de inóculo primario: Es fundamental evitar la llegada de nuevo material infectado, y en este sentido solo cabe extremar las medidas de control y cuarentena sobre la importación de material vegetal, para así disminuir todo lo posible el riesgo de nuevas entradas de patógeno. - Dispersión a través de material de injerto infectado: Esta es posiblemente la vía principal y más peligrosa de dispersión de inóculo secundario de esta enfermedad en la región en estos momentos. Si la vareta está infectada, el árbol producido lo estará también. Por ello, nunca deben utilizarse varetas (púas) para injertar obtenidas en fincas con síntomas o sospecha de esta enfermedad, ni siquiera aunque estos no sean evidentes, y se deben extremar las medidas fitosanitarias en la producción de árboles de mango en viveros. En este trabajo se han realizado algunos ensayos dirigidos a la puesta a punto de métodos de termoterapia para la obtención de material de vivero libre del patógeno. No obstante, en los ensayos preliminares con varios aislados de Fusarium, la aplicación de tratamientos a 40-45 ºC durante hasta 3 horas no se han mostrado suficientemente eficaces para la inactivación de suspensiones de esporas del hongo, y el empleo de temperaturas superiores compromete la viabilidad de las púas. - Saneamiento de las fincas infectadas: Otra vía importante de diseminación de la enfermedad, es la dispersión de esporas desde árboles afectados a otros árboles en la propia finca o fincas colindantes, especialmente en la época de la floración. Ya que los tratamientos químicos no se han mostrado eficaces (Freeman et al., 2014), la mejor manera de combatir esta vía es la realización de podas de saneamiento de las fincas afectadas. Para evitar la dispersión del patógeno una vez se ha detectado su presencia en la finca, se recomienda realizar labores de saneamiento consistentes en cortar las ramas afectadas por debajo de la madera de dos o tres años de edad depositándolas sobre un plástico donde quedarán expuestas al sol durante los meses de verano, alcanzando temperaturas elevadas (Cazorla et al., 2009). De igual forma se aconseja la desinfección de las herramientas utilizadas en las tareas de saneamiento. Durante marzo y abril, cuando se produce el crecimiento de las panículas florales con síntomas, el nivel de esporas es aún bajo, y es el momento más adecuado para realizar la primera poda de ramos afectados. En fincas bastante infectadas se recomienda realizar un mínimo de 3-4 pases de poda en el periodo marzo-agosto, eliminando cualquier foco de infección visible en inflorescencias o brotes vegetativos. Estas recomendaciones han dado resultados satisfactorios en Israel y Sudáfrica, disminuyendo progresivamente año tras año el nivel de infección, pero exigen que se realicen de una forma constante y exhaustiva hasta conseguir la erradicación. En nuestra región, se han obtenido resultados satisfactorios cuando esta práctica se ha aplicado de forma adecuada e intensa, aunque del total de fincas afectadas en que se ha realizado seguimiento (13), únicamente se ha observado erradicación la enfermedad en dos de ellas. Para concluir, tras las prospecciones realizadas en distintas fincas con síntomas de malformación de mango en la Axarquía, se ha confirmado la presencia de esta enfermedad en la región; alcanzando un considerable grado de dispersión, así, se ha confirmado y aislado el agente causal en 35 fincas repartidas en varios términos municipales: Algarrobo, Almáchar, Benamargosa, Benamocarra, Cútar y en varias localidades de Vélez-Málaga. Asimismo se ha observado la infección sobre la mayoría de cultivares, en particular en la principales variedades cultivadas en la Axarquía: Osteen, Keitt, Kent y Tommy Atkins. En relación con la epidemiología de la enfermedad se ha puesto de manifiesto una elevada diversidad genética en las poblaciones de Fusarium, hongo causante de la enfermedad. Así se han identificado aislados de tres especies diferentes: F. mangiferae (descrito como el principal agente causal en el hemisferio Norte), F. tupiense, y dos aislados de Fusarium próximos a F. phyllophilum, pero también patógenos aunque no corresponden a ninguna especie antes descrita como agente causal de la MMD. Así mismo se han detectado tres genotipos diferentes entre los aislados de la especie F. mangiferae. Todos ellos ya presentes en 2009 en la zona, lo que indica que al menos se han producido cinco entradas diferentes de inóculo primario antes de 2009, no habiéndose detectado nuevos genotipos a partir de ese año. Asimismo los dos genotipos mayoritarios en la zona (F. mangiferae genotipo 1 y F. tupiense) ya fueron aislados en 2006. En cuanto a la distribución de las dos especies mayoritarias, mientras en 2009 se observaba un predominio de F. mangiferae, en años posteriores la especie predominante ha sido F. tupiense. Esta especie se está expandiendo en la Axarquía de una forma aparentemente más eficaz que F. mangiferae. Así en 20 de las 22 fincas infectadas, muestreadas por primera vez entre 2010 y 2012, el patógeno aislado ha sido F. tupiense. Aunque su procedencia es desconocida, el hecho de que la población (homogénea) de aislados de esta especie encontrados en la Axarquía sean prácticamente idénticos a uno de los genotipos descritos en Brasil sugiere que tuvo lugar al menos una introducción del patógeno y que éste se ha ido dispersando probablemente a través de material de injerto contaminado. En buena medida, parece observarse que las fincas afectadas que han sido sometidas a un manejo adecuado y exhaustivo han reducido la afectación, resta insistir en la necesidad de extremar las medidas de control y cuarentena sobre la importación de material vegetal para disminuir todo lo posible el riesgo de nuevas entradas de patógeno.
Keywords: Mango - Enfermedades y plagas -Tesis doctorales; Fusarium; Diversidad de poblaciones; Malformación del mango