Regulación Transcripciones del Gen GLS2 y Obtención de Células Madre Embrionarias Transformadas para Generación de Ratones Knockout - Tosina García, Marta (Servicio de Publicaciones y Divulgación Científica, 2016)
La enzima glutaminasa activada por fosfato (GA) cataliza la hidrólisis del grupo amido de la glutamina (Gln) para rendir glutamato (Glu) y amonio. Esta enzima es esencial para el ciclo Gln-Glu entre neuronas y astrocitos y, por tanto, fundamental para la generación del importante neurotransmisor Glu. En humanos, la familia GA está constituida por dos miembros principales localizados en genes distintos y situados en cromosomas diferentes: el gen GLS (cromosoma 2), codifica a las isoenzimas KGA y GAC; mientras que el gen GLS2 (cromosoma 12) codifica para las isoenzimas LGA y GAB. Genes ortólogos a los genes humanos GLS y GLS2 se han descrito en otras especies de mamíferos como ratón y rata. El hecho de que existan dos genes para la GA y de que se hayan identificado diferentes sublocalizaciones celulares para las glutaminasas GLS (mitocondria) y GLS2 (mitocondria y núcleo) nos hace plantearnos el papel que desempeñan en cada sublocalización, además del meramente catalítico, especialmente en cerebro. Un modelo transgénico nulo para el gen Gls2 podría ser una herramienta fundamental para elucidar la función cerebral de esta(s) isoenzima(s). Por otra parte, los mecanismos moleculares que controlan la transcripción son esenciales para comprender la expresión tejido-específica de GA y su alteración en condiciones patológicas, como el cáncer y enfermedades neurológicas. En la presente tesis doctoral se han llevado a cabo estudios relacionados con los dos objetivos principales indicados, llegando a los resultados y las conclusiones que mencionamos a continuación. Se ha diseñado y generado una construcción transgénica para el silenciamiento génico condicional del gen Gls2 murino. La construcción rendirá animales KO nulos para la isoenzima GAB y condicionales para LGA. Además, se ha adquirido una construcción transgénica del consorcio EUCOMM para el silenciamiento génico completo del gen Gls2 murino. Mediante microinyección en blastocistos se han obtenido animales quiméricos que se cruzarán para seleccionar aquellos donde la mutación se haya incorporado a la línea germinal, permitiendo obtener una colonia de animales fundadores. Mediante una combinación de técnicas de biología molecular, bioquímicas y bioinformáticas, hemos obtenido evidencia experimental directa que demuestra, por vez primera, la existencia de transcritos alternativos de los genes ortólogos Gls2 de ratón, rata y humano. Existen al menos dos transcritos sentido de mRNA codificados por el gen GLS2: un transcrito largo denominado GAB y un transcrito corto, LGA, que posee un sitio alternativo de inicio de la transcripción que omite el exón 1 del gen GLS2. También hemos identificado que la variante LGA posee un promotor alternativo situado al final del intrón 1 del gen GLS2 y separado una distancia de 7 kb del promotor canónico del transcrito GAB humano. El promotor LGA posee secuencias de reconocimiento de importantes factores de transcripción. Ambos promotores del gen GLS2 difieren notablemente en su grado de metilación y contenido en islas CpG, lo que permite especular que poseen una regulación transcripcional diferencial. En los estudios de RT-PCR empleando poli(A+)-mRNA hemos aislado transcritos sin sentido correspondientes a tres pseudogenes: uno en ratón y dos en humano. También se ha conseguido clonar y expresar el cDNA del transcrito LGA humano. Aunque dos polipéptidos diferentes fueron trascritos y traducidos con igual eficiencia en un sistema de expresión in vitro, solo el polipéptido completo traducido desde el primer codón de iniciación mostró actividad enzimática. Las isoenzimas GAB y LGA se expresan diferencialmente en cerebro, hígado y en células de neuroblastoma humano. Los cambios de expresión fueron tejido- y especie-específicos, aunque se desconoce su implicación funcional en estados normales y patológicos, fundamentalmente cáncer y alteraciones neurológicas. Con los presentes resultados nos hemos acercado a la obtención de modelos de ratones nulos para Gls2, así como hemos conseguido describir mecanismos de regulación transcripcional y caracterizar los transcritos del gen GLS2.
Keywords: Glutaminasa - Tesis doctorales; Gls2; GAB; LGA; Knockout