Tomato chlorosis virus (ToCV) pertenece al género Crinivirus dentro de la familia Closteroviridae donde se engloban los virus de RNA de cadena sencilla y polaridad positiva de mayor tamaño y complejidad entre los virus de RNA de plantas. ToCV posee un genoma bipartito, donde el RNA1 codifica las proteínas implicadas en replicación viral y el RNA2 las implicadas en encapsidación, movimiento y transmisión. Aunque ambos RNAs son necesarios para obtener una infección productiva en planta, el RNA1 puede replicarse independientemente. En contraste, el RNA2 es completamente dependiente de las proteínas codificadas en el RNA1 para su replicación. Como ha sido descrito para otros miembros de esta familia, ToCV codifica en su genoma hasta tres proteínas con actividad supresora del silenciamiento por RNA. Así, mientras que en el RNA2 esta función supresora del silenciamiento es llevada a cabo por las proteínas estructurales CP y CPm, en el RNA1 esta actividad supresora es realizada por una proteína que parece específicamente dedicada a ello, la proteína p22. La proteína p22, codificada en el extremo 3´ del RNA1 de ToCV, ha sido descrita como una de las proteínas cuya actividad supresora del silenciamiento por RNA es de las más duraderas a lo largo del tiempo, en ensayos de expresión transitoria en planta (Cañizares, et al., 2008). En este trabajo nos hemos centrado en el estudio de esta proteína, donde la finalidad última ha sido conocer el modo en que, por mediación de p22, ToCV es capaz de hacer frente a una respuesta defensiva por parte de la planta basada en el silenciamiento por RNA, estando interesados en conocer también el papel de p22 cuando es expresada a partir de virus heterólogos.
Para todo ello, en primer lugar, ya que en este grupo de virus la región del genoma donde se localiza p22 tiene implicaciones evolutivas, hemos realizado un estudio de la variabilidad genética de la región del RNA1 que codifica p22 en aislados de ToCV de tomate y pimiento. Estos resultados han mostrado que se trata de secuencias muy conservadas, en donde la poca variabilidad existente se concentra en la región carboxilo terminal de la proteína. Aunque altamente conservadas, el análisis filogenético mostró una clara separación de las secuencias de p22 en 2 grupos, llamados tipo I y tipo II. Ensayos de supresión de silenciamiento realizados con proteínas del tipo I y II, mostraron una similar duradera actividad supresora de silenciamiento a lo largo del tiempo en ambos casos. Parece, por tanto, que la presencia de un supresor de silenciamiento con actividad supresora de larga duración es una característica conservada entre los aislados de ToCV.
Una vez confirmado que codificar una proteína con actividad supresora de larga duración parecía ser importante para las poblaciones de ToCV, el siguiente objetivo consistió en conocer el posible mecanismo de acción responsable de la misma. Así, la realización de ensayos de unión in vitro mostró que p22 une preferentemente RNAs de doble hebra (dsRNAs) de tamaño largo, interfiriendo con la acción de corte de Dicer, inhibiéndose de este modo la generación de RNAs pequeños (sRNAs). La actuación de p22 en este punto temprano de la cascada de silenciamiento, podría ser una de las razones de esta actividad supresora de larga duración, ya que se bloquearía desde un primer momento la generación de sRNAs. Estos resultados in vitro se correlacionaron con los obtenidos en ensayos de supresión de silenciamiento inducidos por construcciones en horquilla in planta.
Una vez conocido uno de los posibles mecanismos de acción de p22 cuando ésta se encontraba aislada de su contexto viral, el siguiente objetivo consistió en conocer cómo p22, durante el ciclo de infección viral, mediaba frente a una respuesta defensiva de la planta basada en el silenciamiento por RNA. Ya que, entre los componentes de la cascada de silenciamiento, RDR6 juega un papel fundamental en defensa antiviral, se comenzó estudiando si RDR6 tenía algún papel en defensa frente a ToCV. El notable incremento en los niveles de acumulación de ToCV observado en plantas defectivas para la expresión de RDR6 (plantas RDR6i), comparado con los de plantas silvestres, indicaban que éste era el caso. Para conocer si durante el proceso de infección viral, p22 tenía algún papel frente a este componente de la cascada de silenciamiento, se creó un mutante de deleción de p22 de ToCV (ToCV∆p22). En primer lugar se estudió el papel de p22 durante el ciclo de infección viral en ensayos a nivel local. Curiosamente, los resultados mostraron que la ausencia de p22, además de no afectar a la replicación del RNA1, estaba asociada con la desregulación del ratio de cadenas positivas y negativas del virus, aumentando estas últimas, no teniendo RDR6 ningún efecto apreciable a este nivel. En el caso de ToCV∆p22 el incremento en cadenas negativas correspondientes al RNA1, que resulta en un incremento en los niveles de acumulación de cadenas positivas a partir de las cuales las proteínas requeridas para la replicación podrían traducirse, no se correlacionó con un incremento en los niveles de acumulación del RNA2. Por otra parte, los ensayo a nivel sistémico mostraron que aunque el mutante ToCV∆p22 tenía reducida la capacidad de infectar sistémicamente plantas de N. benthamiana silvestres, esta capacidad era rescatada en plantas RDR6i, lo que indicaba la existencia de una conexión entre p22 y RDR6.
Por último, y ya que las proteínas supresoras de silenciamiento están frecuentemente asociadas a interacciones de tipo sinérgico, el último objetivo de esta tesis consistió en estudiar el efecto de la expresión de p22 a partir de los virus heterólogos Tobacco rattle virus (TRV) y Potato virus X (PVX). Estos resultados mostraron que, aunque se produjo un fuerte sinergismo en síntomas que conducía a la muerte de la planta cuando p22 se expresaba a partir de ambos virus, sólo en el caso de TRV, éste iba acompañado de un aumento en los niveles de acumulación viral. La expresión heteróloga de p22 no era capaz, sin embargo, de complementar a mutantes de virus defectivos en la expresión de proteínas con actividad supresora.