Análisis genómico y funcional de las singularidades de dos cepas de Bacillus amyloliquefaciens con capacidad de biocontrol

Abstract

Las cepas de Bacillus spp. CECT 8237 y CECT 8238 muestran una eficaz capacidad de biocontrol, en comparación con otras cepas relacionadas, frente a agentes patógenos causantes de enfermedades en cucurbitáceas, de ahí que se esté trabajando en su formulación de cara a su utilización como agentes de control biológico en programas de control integrado. Con el fin de conocer la maquinaria génica relacionada con esta actividad, en esta tesis doctoral se ha llevado a cabo la secuenciación y anotación de las secuencias de los genomas completos de estas dos cepas de Bacillus, y se ha demostrado la funcionalidad de algunas de las regiones genómicas contenidas en dichas secuencias. En primer lugar, mediante análisis filogenéticos multigénicos, se han identificado ambas cepas como pertenecientes a la especie Bacillus amyloliquefaciens, más concretamente, relacionadas con cepas asociadas al entorno de la planta, es decir, aislados procedentes de rizosfera o filosfera. En segundo lugar, se ha hecho un estudio exhaustivo de los genes potencialmente implicados en los diversos mecanismos de acción que llevan a cabo estas cepas en su actividad de biocontrol. Para ello, se ha realizado una búsqueda de: i) genes relacionados con la colonización y persistencia en la planta a proteger por parte de estas bacterias; ii) genes que participan en los fenómenos de promoción de crecimiento e inducción de la respuesta de defensa (ISR, del inglés Induced Systemic Resistance) de la planta hospedadora; iii) genes implicados en la síntesis de metabolitos secundarios. Como resultado de este análisis, obtuvimos que las secuencias de los genes relacionados con factores complementarios y rutas de regulación para la formación de biofilms en CECT 8237 y CECT 8238, están poco conservadas con respecto a las secuencias contenidas en otros genomas de Bacillus de especies relacionadas, lo que podría explicar, en cierta medida, los diferentes fenotipos observados en cuanto a morfología de colonia. En relación a los genes que participan en los fenómenos de ISR y fitoestimulación, no se han observado diferencias con respecto a otras cepas del género Bacillus en cuanto al contenido génico; además, se ha demostrado la funcionalidad de los genes relacionados con la producción de los compuestos volátiles acetoína y 2,3-butanodiol, así como las cinéticas de producción asociadas a dichas moléculas, las cuáles si difieren con respecto a otras cepas de B. amyloliquefaciens y B. subtilis. Además, se han identificado grupos de genes para la síntesis de una gran variedad de metabolitos secundarios implicados tanto en la actividad antimicrobiana desempeñada por estas cepas, como en su fisiología. En concreto, mediante análisis químicos, detectamos en los sobrenadantes asociados a las células de estas bacterias, las masas moleculares correspondientes a los poliquétidos macrolactina, dificidina y bacillaene, así como al dipéptido bacilisina y al sideróforo bacilibactina. En tercer lugar, se consideró de gran relevancia la detección de regiones genómicas exclusivas o poco conservadas en los genomas de CECT 8237 y CECT 8238, con respecto a otras cepas de la misma especie, o incluso del mismo género; para ello, se llevó a cabo un análisis genómico comparativo con un gran número de cepas pertenecientes a dicho género y cuyas secuencias estaban disponibles en las bases de datos. Se retuvieron aquellas regiones del genoma que comprendían un mínimo de siete genes consecutivos cuya medida de conservación era inferior o igual al percentil treinta. Entre estas regiones se detectaron principalmente grupos de genes potencialmente implicados en la síntesis de nuevos metabolitos secundarios, cuya funcionalidad y estructura asociada se estudiará en próximos trabajos. Por último, se ha caracterizado una de las regiones genómicas identificadas como exclusivas dentro de la especie y presente en la cepa B. amyloliquefaciens CECT 8237. Esta región parece haberse adquirido por transferencia horizontal, dado su presencia únicamente en otra cepa de distinta especie, Bacillus licheniformis 9945A. Se ha probado la implicación de este grupo de genes en la síntesis de un nuevo lantibiótico, demostrando la funcionalidad de los genes a nivel transcripcional, así como la presencia de los péptidos asociados a dicho lantibiótico en los lavados de células y sobrenadantes de cultivos de CECT 8237. Además, se ha estudiado la producción de este compuesto en condiciones estáticas de crecimiento, tanto in vitro como in planta, en relación a otros metabolitos cuya funcionalidad ya había sido demostrada previamente. Como conclusión general, se puede decir que se ha conseguido profundizar más en los diversos mecanismos de acción desempeñados por estas cepas que son los que desencadenan esa remarcable actividad de biocontrol; pero sobre todo, se ha abierto un gran abanico de posibilidades de cara a futuros estudios para resolver algunas de las cuestiones que aún desconocemos, como son la funcionalidad de nuevas regiones que podrían estar relacionadas con la adaptabilidad al entorno y/o contribución a la mejora de la salud de la planta por parte de estas bacterias.