Variabilidad genética de cuasiespecies de virus RNA y ssDNA in vivo ante cambios en la tasa de error

Abstract

El objetivo general de esta tesis es entender la estructura poblacional in vivo de las cuasiespecies de virus de RNA y ssDNA cuando se altera su variabilidad genética debido a cambios en la tasa de error. El abordaje de este objetivo general lo hemos llevado a cabo desde dos aproximaciones diferentes. Por un lado, hemos estudiado las bases moleculares de la mutagénesis letal in vivo por tratamiento de un virus RNA de plantas, el virus del mosaico del tabaco (TMV) con un agente mutagénico. Para ello infectamos plantas de Nicotiana tabacum crecidas in vitro y las tratamos durante 10 días en presencia de diferentes concentraciones del análogo de base 5-fluorouracilo (5-FU). Tras el tratamiento cultivamos las plantas 21 días sin análogo ex vitro. Las poblaciones de RNA genómico de TMV se cuantificaron por RT-qPCR y se determinó su infectividad por ensayo de lesiones locales. Además se secuenció por Sanger un amplicón conteniendo parte del ORF que codifica la RNA polimerasa (RdRp) y el ORF de la proteína MP para obtener la secuencia consenso y, tras su clonaje, secuencias de clones moleculares del espectro de mutantes. Los resultados mostraron que el 5-FU reduce la infectividad de TMV pero no la acumulación de moléculas genómicas lo que disminuye su infectividad específica y que esta es recuperada tras 21 días sin análogo. El análisis de la complejidad y heterogeneidad así como el tipo de mutaciones predominantes, indica que el efecto antiviral del análogo está más relacionado con el efecto del mismo sobre la distribución de la variabilidad genética originada por la acción el 5-FU y que esta actúa de diferente manera en las dos regiones analizadas. Este trabajo apoya el modelo de defección letal para la mutagénesis letal in vivo de TMV y abre las puertas a emplear este sistema de virus RNA en plantas para el estudio in vivo de las bases moleculares de la mutagénesis letal mediante agentes mutagénicos. En segundo lugar de esta tesis hemos desarrollado una herramienta bioinformática llamada QuasiFlow para poder analizar simultáneamente y de manera sencilla, robusta y rápida la variabilidad de las cuasiespecies virales a partir de datos de NGS. Esta herramienta nos ha permitido reconstruir haplotipos completos, detectar genomas virales recombinantes y variantes genómicas minoritarias presentes en los espectros de mutantes de geminivirus en coinfecciones de Tomato yellow leaf curl virus-Mld, Tomato yellow leaf curl virus-IL, Tomato yellow leaf curl Malaga virus en tomate. Además, hemos podido demostrar la versatilidad de Quasiflow al extender su utilización a un estudio sobre variantes genómicas minoritarias en muestras de genomas DNA mitocondrial. Por último, hemos abordado el estudio del origen de la variabilidad genética de un virus de DNA de cadena sencilla, el geminivirus TYLCV, mediante las nuevas tecnologías de secuenciación masiva en combinación con el análisis de QuasiFlow. Estos virus de ssDNA se caracterizan por tener una variabilidad genómica similar a la de virus RNA. Sin embargo, sus genomas carecen de genes codificantes para una DNA polimerasa replicativa, por lo que esta variabilidad debe ser originada por polimerasas celulares. En la célula, además de DNA polimerasas replicativas, se han identificado DNA polimerasas de tolerancia al daño o de síntesis de translesión con altas tasas de error. En esta Tesis hemos estudiado el papel de las DNA polimerasas de la Familia Y de Arabidopsis thaliana en la variabilidad de las cuasiespecies de TYLCV. Nuestros resultados apoyan la hipótesis de que dado que el DNA monocatenario es más susceptible al daño, estas polimerasas intervendrían en su reparación llevando a cabo una acción mutadora sobre él. Además, recientemente se ha descubierto en humanos una DNA primasa-polimerasa llamada PrimPol, con cierta actividad TLS que, conforme a nuestros resultados, podría estar implicada en las fases iniciales de la infección de TYLCV así como contribuir a la variabilidad genética de geminivirus interviniendo en la recombinación ilegítima de sus genomas.