Caracterización de los promotores de las proteínas antivirales Mx1, Mx2 y Mx3 de dorada (Sparus aurata)

Abstract

La dorada es una especie de gran interés para la Acuicultura del Sur de Europa. Las notables pérdidas en la acuicultura moderna debidas a patologías de distinta índole, han suscitado entre los científicos la necesidad de conocer las características de las interacciones patógeno-hospedador. La falta de tratamientos efectivos contra infecciones víricas, ha motivado el desarrollo de nuevas técnicas y aplicaciones biotecnológicas como medida preventiva. Para ello, el estudio de las proteínas antivirales Mx en peces resulta interesante, sobre todo en especies que se comportan como portadores asintomáticos de diversos virus, como es el caso de la dorada (Sparus aurata). Las proteínas Mx tienes propiedades antivirales y han sido estudiadas en otras especies con resultados prometedores. Además el cDNA de las proteínas Mx1, Mx2 y Mx3, han sido previamente clonados y caracterizados por nuestro grupo de investigación, lo cual ha motivado el estudio de sus promotores con el fin de comprender como se regulan estas interacciones patógeno-hospedador. El objetivo de este trabajo consistió en la caracterización estructural y funcional de las proteína antivirales Mx1, Mx2 y Mx3 de Sparus aurata.

Para la caracterización estructural fue necesario la clonación y secuenciación de las regiónes 5’ reguladoras mediante la estrategia de Genome Walking, el análisis filogenético entre las secuencias obtenidas, el análisis comparativo con promotores de Mx de otras especies de peces y vetebrados superiores, la determinación de los motivos reguladores más relevantes que lo componen mediante el estudio bibliográfico.

El análisis funcional se llevó a cabo mediante: la construcción de distintas construcciones plasmídicas, de los promotores completos y con algunas deleciones de los elementos reguladores más relevantes, en un vector (pGL4.22Luc-Puro2CP) que contiene gen de la luciferasa como reporter para la medición de la actividad de estos promotores; la determinación de la actividad antiviral in vitro mediante inmunoestimulación con poli l:C e infección vírica experimental, en células de trucha arcoíris RTG-2 (Rainbow trout) transfectadas con cada una de las construcciones realizadas mediante electroporación, para lo que fue necesario la optimización del el proceso de nucleofección a fin de obtener la mayor eficiencia; y el establecimiento de células estables seleccionadas expresando las construcciones reporter/promotor, para el estudio del posible efecto antagonista de los virus IPNV o Virus de la Necrosis Pancreática Infecciosa (genotipo Sp), y el VHSV o Virus de la septicemia hemorrágica viral (cedido por el Dr C.P. Dopazo, de la Universidad de Santiago de Compostela) en la ruta del interferón. Para ello se realizó un ensayo de protección celular, en el que las células se estimularon primero con poli I:C, y a continuación se inocularon con cada uno de los dos virus.

Las secuencias de los promotores completos presentaron 943, 1188 y 1226 nucleótidos para Mx1, Mx2 y Mx3, respectivamente. Estas secuencias se depositaron en la base de datos Genebank, con números de acceso JQ392566, JQ392567 y JQ392568. Presenta la estructura típica de promotores de genes inducidos por IFN-α/β en los que la presencias de secuencias diana ISRE (Elemento de Respuesta a Interferon o Interferon Stimulated Response Ratio) son responsables de la activación de estos genes antivirales como respuesta a una infección. La secuencia que contenía este elemento estaba muy conservada en los tres promotores. Otras dianas de elementos reguladores como secuencias GAS de respuesta a IFN-γ e IL-6 fueron localizadas, así como elementos de gran similitud a las ISRE denominadas ISRE-like, y que contenían alguna mutación puntual respecto a la canónica. Destacó la ausencia de caja TATA, salvo en Mx2, lo cual indujo a pensar el diferentes sitios de inicio de las trasncripción o en promotores alternativos. Todos estos motivos fueron encontrados además en secuencias intrónicas, destacando un número muy elevado sobre todo en el intrón 1, lo cual hizo pensar en la posible participación de este intrón en la regulación de estos genes.

Funcionalmente, los tres promotores respondían a la estimulación con poli I:C e infecciones víricas con IPNV y VHSV aunque con diferentes rangos de inducción, destacando la elevada actividad de inducción de Mx2 frente a los otros dos. Las características de la inducción de cada uno fueron dosis-dependiente, mostrándose mayores valores de inducción con 10 µg/mL en cuanto a la inducción con poli I:C, y de 0.01 MOI y 0.1 MOI para IPNV y VHSV respectivamente. La menor inducción observada a mayor concentración de virus IPNV fue un indicio del posible efecto antagonista del virus en esta ruta. Se observó a demás una dependencia temporal en ambos casos, siendo la respuesta más rápida por inducción con poli I:C (máximo 24 h) que con virus (máximo 72 h). La cinética de inducción de cada promotor resultó ser similar para los tres, siendo más elevado para Mx2. En el caso de IPNV, se detectó un claro efecto antagonista del virus sobre la actividad de pMx2, ya que, en todos los casos, la presencia del virus hizo disminuir de forma significativa la estimulación de este promotor causada por poli I:C. La capacidad del IPNV de interferir con la cascada de señalización de IFN, siendo la transcripción de Mx una de las dianas de actuación de este virus.

En el caso de la dorada, es altamente probable que la diversidad funcional detectada en los promotores de sus tres genes Mx, juegue un papel fundamental en la exitosa estrategia antiviral desarrollada por esta especie.