La fresa (Fragaria xananassa) es un fruto altamente consumido y apreciado por su delicado sabor, aroma y valor nutritivo (Tulipani et al., 2008; Giampieri et al., 2012). El cultivo de fresa se ha extendido por todo el mundo ocupando en la actualidad una superficie de 254.000 hectáreas y una producción aproximada de 4 millones de toneladas con una distribución global del 42.8%, 29.2%, 18.4%, 8.8% and 0.8% en América, Europa, Asia, África y Oceanía, respectivamente (FAOSTAT, 2012; http://faostat3.fao.org). España ocupa el primer lugar mundial dentro de los exportadores de fresas y el cuarto en relación a producción (FAOSTAT, 2012), siendo la provincia de Huelva, comunidad autónoma de Andalucía, el principal productor, en donde se concentra aproximadamente el 95% de la producción nacional. España ocupa un puesto privilegiado no sólo en producción sino también en exportación y desarrollo de programas de mejora de variedades, lo que genera retornos importantes tanto en la comercialización de fruta en fresco como los generados por "royalties". En los últimos años, los programas de mejora se han centrado en caracteres tales como productividad y morfología, entre los que destacan el tamaño de fruto, la dureza y el color. Sin embargo, en la actualidad el consumidor está demandando frutos con mayor valor en compuestos saludables (conocidos como nutracéuticos) debido a los efectos beneficiosos de éstos en la salud, lo que influye en toda la cadena de distribución y producción. Este hecho ha producido un giro en la selección de nuevas variedades buscando, además de los aspectos agronómicos, una mejora en la calidad organoléptica y nutricional. Estos esfuerzos buscan, entre otras cosas, un incremento en la sostenibilidad y competitividad de este cultivo en España, que le permita seguir liderando las exportaciones y e incrementando su producción.
En este escenario, nuestro grupo lleva varios años liderando proyectos de investigación basados tanto en la identificación de genes implicados en la regulación del desarrollo y maduración del fruto de fresa como en la caracterización de herramientas biotecnológicas dirigidas a la mejora de dichos frutos. Uno de los principales intereses del grupo y objetivo de esta tesis doctoral, es el estudio y determinación de la función biológica de los alérgenos Fra de fresa (Fragaria xananassa), que se sabe están involucrados en el control de la ruta de biosíntesis de flavonoides (Muñoz et al., 2010). Los flavonoides son compuestos que, además de ser responsables del color y aroma del fruto de fresa (Fait et al., 2008; Muñoz et al., 2011), son actualmente de gran interés biotecnológico debido a las propiedades nutricionales, farmacéuticas y medicinales que presentan para el consumo humano (Hichri et al., 2011; Giampieri et al., 2013). La identificación de estos alérgenos fue resultado de los estudios de Emanuelsson y colaboradores que, motivados por la observación de que ciertas variedades blancas de fresa eran bien toleradas por individuos que presentaban reacciones alérgicas a variedades rojas, realizaron un estudio proteómico de variedades comerciales de ambos tipos de frutos (Karlsson et al., 2004; Hjerno et al., 2006). Finalmente, pusieron de manifiesto que las variedades blancas de fresa presentaban un contenido en la proteína FaFra1, potencial alérgeno de fresa, significativamente inferior al de las variedades rojas. Posteriormente, en nuestro laboratorio se identificaron dos genes codificantes de nuevas isoformas del alérgeno Fra (FaFra2 y FaFra3) y se estableció una relación entre la expresión de dichos genes y la ruta de biosíntesis de flavonoides que sugería un papel regulador de las proteínas FaFra en esta ruta biosintética (Muñoz et al., 2010).
Las proteínas Fra de fresa pertenecen a la familia de proteínas PR-10 ("pathogenesis-related 10 proteins"), denominadas de esta forma por su relación con la respuesta de las plantas frente a patógenos (Markovic-Housley et al., 2003). A su vez, las proteínas Fra, también forman parte de la superfamilia de proteínas Bet v 1, cuyo principal representante es el alérgeno del polen de abedul (que da nombre al grupo), y que engloba una variedad de alérgenos, no sólo de polen, sino también de frutas y alimentos (Markovic-Housley et al., 2003; Fernandes et al., 2013). Sin embargo, aunque las propiedades alergénicas de este tipo de proteínas han sido ampliamente estudiadas, sus funciones y mecanismos de actuación en las plantas que las producen permanecen prácticamente desconocidos (Mogensen et al., 2007). Para investigar la función biológica desempeñada por los alérgenos FaFra en el fruto de fresa y poder establecer el papel que estas proteínas juegan en la regulación de la biosíntesis de flavonoides y, finalmente, obtener información sobre la funcion de las proteínas de tipo PR-10 ampliamente distribuidas en el reino vegetal, en este trabajo se abordaron los siguientes objetivos:
I. Caracterización de la familia multigénica Fra de fresa (Fragaria xananassa), para profundizar en el estudio de su efecto en el control de la ruta de biosíntesis de flavonoides.
II. Búsqueda de potenciales ligandos naturales de las proteínas FaFra mediante el empleo de técnicas bioquímicas y biofísicas.
III. Análisis estructural de las proteínas FaFra para obtener detalles sobre su mecanismo de actuación a nivel molecular.
INTRODUCCIÓN
La Fresa
La fresa pertenece a la familia Rosaceae y al género Fragaria. En Fragaria, existen cuatro grupos básicos de fertilidad que se asocian principalmente con el número de ploidía o número de cromosomas. La especie silvestre más común, F. vesca L., presenta 14 cromosomas, es diploide y sirve de modelo experimental para el género (Shulaev et al., 2011). La fresa cultivada es, sin embargo, una especie octoploide de 56 cromosomas que procede del cruce de las especies F. chiloensis y F. virginiana, ambas especies octoploides (Rousseau-Gueutin et al., 2009). Uno de los cultivares más ampliamente extendido en todo el mundo es “Camarosa”, ideal para inviernos suaves, como es el caso de Huelva en España. Siendo esta la variedad donde hemos realizado mayoritariamente nuestras investigaciones.
De forma general, los frutos pueden clasificarse como climatéricos o no-climatéricos en función del patrón de respiración y la producción de etileno que tienen lugar a lo largo del proceso de maduración (Grierson, 2013). El fruto de fresa sirve como modelo para el estudio de los frutos no-climatéricos; en estos, no se observa un aumento drástico en la tasa de respiración durante la maduración ni tampoco una elevada producción de etileno (Iannetta et al., 2006). La fresa es, además, un fruto muy particular ya que, a diferencia de otros frutos botánicamente definidos como resultado de la expansión del ovario, la fresa es en realidad un receptáculo floral engrosado, compuesto de una médula central o corazón, un receptáculo carnoso, la epidermis y un conjunto de haces vasculares que conectan los aquenios, que son los verdaderos frutos de la fresa. Los aquenios, que son una combinación de tejido del ovario y de la semilla y se originan en la base de cada pistilo, se disponen de forma helicoidal en la superficie del fruto y se encuentran insertados en la capa epidérmica del receptáculo (Perkins-Veazie, 1995).
Todo esto hace que el estudio del fruto de fresa sea especialmente interesante tanto desde el punto de vista genético como fisiológico.
Composición Fenólica del Fruto de Fresa
La fresa se caracteriza por ser un fruto con un alto contenido en metabolitos secundarios, muchos de ellos considerados como compuestos “bioactivos”, ya que se ha demostrado que presentan efectos beneficiosos para la salud humana (Diamanti et al., 2012; Giampieri et al., 2013). En particular, las fresas son ricas en minerales, vitamina C, folato y compuestos fenólicos. Los compuestos fenólicos no sólo poseen propiedades antioxidantes y anti-carcinogénicas (Scalzo et al., 2005, Tulipani et al., 2008; Giampieri et al., 2013) sino que además, juegan un papel esencial en la biología del fruto, puesto que no sólo son los principales responsables del color y sabor de la fresa, sino que también desempeñan funciones tan importantes como la defensa frente a patógenos y a condiciones ambientales adversas, como puede ser la exposición a la radiación ultravioleta (Aaby et al., 2005, 2007).
Los compuestos fenólicos se sintetizan a partir de L-fenilalanina a través de las rutas de biosíntesis de fenilpropanoides y flavonoides (Tohge et al., 2013). Entre la gran variedad de compuestos fenólicos presentes en la fresa, los mayoritarios son los flavonoides. La síntesis de estos compuestos tiene lugar en dos fases durante el desarrollo del fruto de fresa, lo cual está íntimamente relacionado con la función que cada uno de estos metabolitos desempeña a lo largo de la maduración (Halbwirth et al., 2006; Aaby et al., 2007; Fait et al., 2008). Durante las primeras etapas del desarrollo del fruto, los flavonoides principalmente acumulados en la fresa son de tipo flavan-3-ols y proantocianidinas; estos metabolitos, son responsables del sabor astringente de los frutos inmaduros. En las etapas más tardías del desarrollo, cuando el fruto comienza a madurar, se incrementa la síntesis de otros compuestos flavonoides, entre ellos, antocianinas y flavonoles, que contribuyen a la coloración de frutos y flores (Halbwirth et al., 2006, Fait et al., 2008). Las antocianinas son, cuantitativamente, los polifenoles más importantes en el fruto de fresa maduro y están principalmente representados por derivados glucosilados de pelargonidina y cianidina; estos metabolitos son los pigmentos que confieren a la fresa su color característico (Tulipani et al., 2008; Muñoz et al., 2011).
De este modo, la composición fenólica de la fresa no sólo afecta a su valor nutricional sino también a la calidad final del fruto, lo que actualmente se traduce en la existencia de muchas líneas de investigación enfocadas al estudio del desarrollo y maduración del fruto de fresa, incluyendo la síntesis de flavonoides, lo que hace que éste sea un ámbito científico muy relevante.
Proteínas PR-10
Las proteínas relacionadas con patogénesis PR ("Pathogenesis-Related proteins") están ampliamente distribuidas en el reino vegetal y se clasifican en 17 familias (PR1-PR17) en función de su estructura primaria y las propiedades biológicas y bioquímicas que presentan (van Loon et al., 2006; Sels et al., 2008; Fernandes et al., 2013). En un inicio, las proteínas PR se clasificaron en base a la respuesta que inducían frente a patógenos. Sin embargo, más tarde, este término se amplió y se incluyeron en esta familia aquellas proteínas no sólo relacionadas con la defensa a patógenos, sino también aquellas relacionadas con la respuesta a condiciones que mimetizaban el efecto frente a agentes patogénicos, como el estrés abiótico o el daño mecánico (Sels et al., 2008; Lebel et al., 2010). A pesar de que la familia de proteínas PR ha sido ampliamente estudiada, la función de la mayoría de ellas sigue siendo desconocida y, en particular, el papel biológico de las proteínas PR-10 no está bien definido.
Entre las proteínas de tipo PR-10 se encuentra un grupo de alérgenos que pertenece a la superfamilia de proteínas Bet v 1 (Markovic-Housley et al., 2003). Las proteínas Bet v 1 se caracterizan por presentar una estructura muy conservada que encierra una cavidad central que es capaz de unir ligandos hidrofóbicos (Mogensen et al., 2002; Markovic-Housley et al., 2003; Seutter von Loetzen et al., 2013). Actualmente en fresa se conocen tres miembros de la familia Bet v 1: FaFra1, FaFra2 y FaFra3 (Hjerno et al., 2006; Muñoz et al., 2010). Se sabe que las proteínas FaFra están relacionadas con la formación de compuestos coloreados en la fresa (Muñoz et al., 2010), lo que principalmente depende de la producción de ciertos flavonoides como el cianidin-3-O-glucósido y el pelargonidin-3-O-glucósido. Estudios previos desarrollados en nuestro laboratorio (Muñoz et al., 2010), permitieron establecer una relación directa entre las proteínas FaFra y la ruta de biosíntesis de flavonoides. El silenciamiento transitorio (mediado por RNAi) de los genes FaFra en frutos de fresa (cv. Elsanta), puso de manifiesto que el contenido de aquellos metabolitos responsables del color del fruto (cianidin-3-O-glucósido y pelargonidin-3-O-glucósido) se veía reducido en los frutos silenciados. Además de la acumulación de estos compuestos, también se vio afectada la de otros como el kaempferol-3-O-glucósido y el pelargonidin-3-malonil-glucósido que mostraron niveles reducidos en comparación a los frutos control. Sin embargo, no sólo se observó la disminución en la acumulación de estos compuestos sino que también otros metabolitos, como la catequina y ciertas proantocianidinas, aumentaron sus niveles en los frutos silenciados (Muñoz et al., 2010). De forma paralela, se observó que el silenciamiento de los genes FaFra tenía un efecto a nivel transcripcional sobre genes fundamentales de la ruta de biosíntesis de flavonoides, específicamente, fenilalanin-amonio-liasa (PAL) y chalcona sintasa (CHS) aparecían co-silenciados junto a los alérgenos FaFra (Muñoz et al., 2010). Estos resultados indicaban la posibilidad de un papel regulador de las proteínas FaFra en la ruta de biosíntesis de flavonoides. Sin embargo, se carece de información sobre el mecanismo molecular por el cual estas proteínas podrían estar ejerciendo su función.
La estructura conservada de las proteínas PR-10 y su habilidad para unir distintos tipos de ligandos en su cavidad hidrofóbica central indican que la función de la proteínas FaFra en la ruta de biosíntesis de flavonoides podría estar íntimamente relacionada con su unión a un compuesto flavonoide y que, cabría la posibilidad de que cada uno de los miembros de la familia pudiesen unir distintos intermediarios de la ruta. Debido a la presencia de cavidades conservadas en las proteínas PR-10 y su capacidad de unir ligandos, se han propuesto varias funciones para esta familia de proteínas y, en particular para las proteínas de la familia Bet v 1, se han planteado principalmente dos posibilidades: un posible papel como transportadores celulares de metabolitos y una posible función como componentes esenciales en cascadas de señalización (Mogensen et al., 2002; Liu y Ekramoddoullah, 2006; Radauer et al., 2006; Mogensen et al., 2007).
Mediante la caracterización de la familia multigénica FaFra y el estudio bioquímico, biofísico y estructural de las proteínas FaFra en presencia y ausencia de intermediarios de la ruta de biosíntesis de flavonoides, este trabajo tiene como objetivo principal aclarar el papel de las proteínas FaFra de fresa en la regulación de la ruta de biosíntesis de antocianos. Este trabajo debería también contribuir al el entendimiento general del la función biológica de las proteínas PR-10, que se encuentran ampliamente distribuidas en el reino vegetal.
RESULTADOS Y DISCUSIÓN
I. Caracterización de la Familia Multigénica Fra de Fragaria xananassa
Recientemente ha sido publicado el genoma de la especie Fragaria vesca (F. vesca) que sirve como modelo para el género Fragaria (Shulaev et al., 2011). Esto ha generado un conjunto de herramientas muy valiosas que, en nuestro caso, han sido muy útiles para profundizar en el estudio de la familia de genes Fra de Fragaria xananassa (FaFra). Por otro lado, los grandes avances alcanzados en los últimos años en el campo de la secuenciación masiva de RNA (RNA-Seq), han hecho que el RNA-Seq se haya convertido en un método muy efectivo para obtener grandes cantidades de datos transcriptómicos de muchos organismos y distintos tipos de tejidos y que, además, se considere como una potente herramienta para estimar tanto la abundancia de los genes expresados en una circunstancia determinada como su expresión diferencial en distintas condiciones de estudio (Grabherr et al., 2010; Trapnell et al., 2010).
En base a estos avances científicos y tecnológicos y para caracterizar la familia multigénica FaFra, se plantearon dos estrategias metodológicas principales, ambas basadas en la secuenciación masiva de RNA mensajero (RNA-Seq) extraído de plantas de fresa. La primera de ellas tenía como objetivos principales la identificación de las secuencias FaFra expresadas en fresa y la determinación de sus perfiles de expresión. Para ello, se recurrió a una experiencia de RNA-Seq que nuestro laboratorio ha desarrollado en plantas pertenecientes al cultivar Camarosa, no solo a lo largo de la maduración de los frutos de fresa en los estadios verde, blanco, viraje blanco-rojo y rojo (en aquenios y receptáculos por separado) sino también en tejidos vegetativos (hoja y raíz). El análisis de datos de RNA-Seq puede llevarse a cabo mediante dos metodologías principales: 1) Alineamiento de las lecturas a un genoma de referencia; 2) Ensamblado del transcriptoma de novo (Martin et al., 2013). Aunque el genoma de la especie F. vesca (diploide) sirve de modelo para el género Fragaria, y el genoma de la especie cultivada Fragaria xananassa (octoploide) presenta un alto grado de conservación con el de la especie salvaje (Bombarely et al., 2010), el hecho de que el genoma de F. vesca es aún incompleto y su anotación necesita mejoras, nos llevó a analizar los datos de RNA-Seq de nuestra experiencia de maduración y tejidos vegetativos de fresa utilizando un ensamblado del transcriptoma de novo, utilizando el método Trinity (Grabherr et al., 2010). El análisis del transcriptoma realizado por nuestro grupo, en colaboración con el Dr. José. F. Sánchez Sevilla del centro IFAPA de Churriana (Málaga), ha permitido obtener una ingente cantidad de datos de expresión de genes. El análisis de los datos de RNA-Seq ha resultado en la identificación de 10 genes putativos principales que conforman la familia Fra (Fragaria xananassa) y ha permitido establecer sus correspondientes homólogos en F. vesca. Los genes FaFra, se han nombrado de forma consecutiva desde FaFra1 a FaFra10 (Tabla 1, Figuras 4-8, Capítulo 1). Además, se han identificado variedades alélicas para muchos de ellos, en particular, FaFra1c1-c2, FaFra2b, FaFra4a1-a2 y FaFra4b1-b2, FaFra7a-b y FaFra9a1-a2. A su vez, las proteínas FaFra se han clasificado en cuatro grupos principales, de acuerdo a su nivel de homología con los alérgenos FaFra1, FaFra2 y FaFra3 previamente publicados (Muñoz et al., 2010); el cuarto grupo, sin embargo, engloba las secuencias FaFra8, FaFra9 y FaFra10 que conforman el conjunto más divergente de proteínas FaFra (Figuras 9 y 10, Capítulo 1). Adicionalmente, se ha obtenido información detallada sobre los niveles de expresión de los genes FaFra tanto en tejidos vegetativos de fresa como a lo largo de los estadios de maduración del fruto, siendo los niveles de mensajeros observados distintos para cada una de los genes identificados. De forma general, los transcritos más representados corresponden a los genes FaFra1c1, FaFra1c2, FaFra2b y FaFra4a1 (Tabla 2, Figura 11-12, Capítulo 1). El tejido donde la expresión de FaFra resultó ser más importante fue la raíz, seguido de receptáculo, donde los genes más representativos fueron FaFra1c1 y FaFra2b; estos genes, mostraron perfiles de expresión complementaria ya que, mientras que FaFra1c1 disminuía a lo largo de maduración, FaFra2b aumentaba su expresión (Figura 11d, Capítulo 1). Además, los niveles de expresión de estos genes, se corresponden con los niveles de proteína observados mediante Western-blot en los frutos de fresa (Figura 3, Capítulo 1).
La segunda experiencia de RNA-Seq, se diseñó con el fin de identificar aquellos genes que se expresaban de forma diferencial en receptáculos control y receptáculos donde se había silenciado de forma transitoria los genes FaFra inyectados con soluciones de Agrobacterium tumefaciens portadoras de construcciones RNAi del gen diana (Hoffmann et al., 2006; Muñoz et al., 2010). En este caso, el análisis de datos de RNA-Seq se llevó a cabo mapeando las lecturas obtenidas al genoma de referencia F. vesca utilizando los programas TopHat2 para el mapeado de secuencias (Kim et al., 2013) y Cufflinks para la cuantificación de lecturas y determinación de la expresión diferencial de genes entre los frutos control y los frutos Fra-RNAi silenciados (Trapnell et al., 2012). Como resultado, 4426 genes se vieron afectados, de los cuales 2528 resultaron sobre-expresados y 1898 reprimidos. Enfocando nuestra atención en la familia de genes Fra y en los genes involucrados en la biosíntesis de flavonoides, concluimos que el silenciamiento de FaFra2A (principal gen FaFra en receptáculo rojo) y FaFra6, afectaba a genes primordiales de la ruta de biosíntesis de flavonoides tales como fenilalanina-amonio liasa (PAL), chalcona sintasa (CHS), cinamato-4-hidroxilasa (C4H), 4-cumarato-CoA-ligasa (4CL), chalcona isomerasa (CHI), dihidroflavonol-reductasa (DFR), flavanona-3-hidroxilasa (F3H) y 3-O-glucosiltransferasa (3-GT), algunos de los cuales se verían sobre-expresados y otros silenciados, siendo los reprimidos los más importantes en cuanto a expresión en receptáculo. Asimismo, los factores de transcripción de tipo R2R3-Myb, FaMYB1 y FAMYB10, aparecieron co-silenciados junto a FaFra2A y FaFra6. Nuestros resultados, de este modo, confirman el papel esencial regulador que ejercen los genes FaFra en la ruta de biosíntesis de flavonoides.
Finalmente, para obtener información sobre la localización subcelular de las proteínas FaFra, se llevaron a cabo ensayos de microscopía confocal en plantas de Nicotiana benthamiana (expresión transitoria) y de Arabidopsis thaliana (generación de líneas transgénicas) expresando proteínas FaFra a fusionadas a la proteína GFP (Fra-GFP). Los ensayos de localización subcelular de las proteínas Fra-GFP en N. benthamiana y A. thaliana, indicaron que las proteínas FaFra, que presentan una localización similar a la proteína GFP libre (nuclear y citoplasmática), podrían tener una localización citoplasmática, al igual que ocurre en la mayoría de las proteínas de tipo PR-10 (Fernandes et al., 2013) sin poder descartar que su localización celular tenga lugar en otro orgánulo (como retículo endoplasmático) y que ésta pudiese depender de su interacción con otras proteínas presentes en la fresa.
II. y III. Búsqueda del Ligando Natural de las Proteínas FaFra y Análisis Estructural
La proteínas de la superfamilia START/Bet v 1 se caracterizan por presentar un plegamiento común formado por siete láminas beta antiparalelas y tres hélices alfa que encierran una cavidad central que es capaz de alojar ligandos hidrofóbicos (Mogensen et al., 2002; Radauer et al., 2008; Fernandes et al., 2013). Nuestra hipótesis inicial planteaba que las proteínas FaFra, que presentan distintos perfiles de expresión a lo largo de la maduración del fruto y tejidos vegetativos de fresa, debían ejercer su función reguladora en la ruta de biosíntesis de flavonoides a través de la unión específica de ligandos de dicha ruta. De este modo, para obtener información sobre el mecanismo de actuación de las proteínas FaFra a nivel molecular, se llevó a cabo la clonación, expresión, purificación y caracterización de las proteínas FaFra1E, FaFra2 y FaFra3. La secuencias codificantes (CDS) de las proteínas FaFra se amplificaron mediante PCR y se clonaron en el vector de expresión pETM11 (Dummler et al., 2005), que introduce una etiqueta hexa-histidina (6xHis-tag) y que presenta un sitio específico de reconocimiento de la proteasa TEV ("tobacco etch virus", virus jaspeado del tabaco) que permite la eliminación de la etiqueta de histidina tras la purificación de la proteína. Para llevar a cabo la expresión de las proteínas, las construcciones FaFra-pETM11 obtenidas se clonaron en E. coli BL21 (DE3). Para inducir la expresión de las proteínas se empleó IPTG (isopropil-β-D-1-tiogalactopiranósido) y la purificación se llevó a cabo mediante cromatografía de afinidad de metales inmovilizados, utilizando una resina de ácido nitrilotriacético de níquel (Ni-NTA) en dos pasos: el primero se purificó la proteína haciendo uso de su etiqueta de histidina y en el segundo se eliminó la proteasa TEV utilizada para cortar dicha etiqueta. Tras el corte de la cola de histidina, tres aminoácidos adicionales (Ala- Met- Ala) quedaron unidos en el extremo N-terminal de las proteínas FaFra. La caracterización de las proteínas heterólogas obtenidas se realizó mediante cromatografía de exclusión por tamaño acoplada a dispersión multiangular de luz láser (SEC- MALLS). Los experimentos de SEC-MALLS indicaron masas moleculares de 18 kDa, 28 kDa y 17.5 kDa para FaFra1E, FaFra2 y FaFra3, respectivamente. En el caso de FaFra1E y FaFra3, los valores obtenidos concordaban con las masas moleculares esperadas, lo que demostraba que ambas proteínas eran monoméricas en solución. Sin embargo, la masa molecular estimada para FaFra2 era superior a lo esperado (17.5 kDa), lo que al final resultó bastante importante ya que, los ensayos posteriores de cristalización, no permitieron obtener cristales de esta proteína en ninguna de las condiciones ensayadas.
Con el objeto de identificar el ligando natural de estas proteínas, se desarrollaron una serie de ensayos de interacción de ligando mediante calorimetría isotérmica de titulación (ITC), en los que se analizaron un conjunto de compuestos pertenecientes a la ruta de biosíntesis de fenilpropanoides y flavonoides, disponibles comercialmente y muchos de ellos potenciales ligandos candidatos por tratarse de metabolitos ampliamente representados en el receptáculo de fresa y por el hecho de que la acumulación de algunos de ellos en la fresa se había visto afectada en los frutos FaFra-RNAi previamente silenciados en nuestro laboratorio (Muñoz et al., 2010). Los ensayos de interacción con ligandos mediante ITC revelaron que, efectivamente, las proteínas FaFra son capaces no sólo de unir intermediarios de la ruta de flavonoides, sino que presentan la capacidad de interaccionar con diferentes metabolitos de la ruta con distinta afinidad en el rango micromolar. Específicamente, se demostró que FaFra1E, FaFra2 y FaFra3 unian quercetin-3-O-glucurónido, miricetina y catequina, respectivamente (Figura 2, Capítulo 3). Además, se sabe que estos metabolitos se acumulan en la fresa (Kosar et al., 2004; Aaby et al., 2007; Hanhineva et al., 2008; Sultana y Anwar, 2008; Muñoz et al., 2011), en estadíos de desarrollo y tejidos similares en los que se registran los valores máximos de expresión de los correspondientes genes FaFra. De forma paralela al análisis ITC se llevaron a cabo la cristalización y determinación estructural de las proteínas FaFra1E y FaFra3, lo que ha generado una gran cantidad de información estructural y mecanística. Tras la obtención de cristales y experimentos de diffracion de rayos X en el synchotron de Grenoble, se determinaron tres estructuras cristalográficas por el método de reemplazamiento molecular (MR): dos correspondientes a FaFra1E en su forma apo y una estructura para el complejo FaFra3-catequina, con resoluciones de 2.2 Å, 3.1 Å y 3.0 Å, respectivamente (Tabla 1, Capítulo 3). Las estructuras obtenidas para FaFra1E nos permitieron determinar que, efectivamente, el plegamiento esperado estaba conservado en las proteínas FaFra (Figura 3, Capítulo 3). Además, se identificaron regiones altamente desordenadas (giros L3, L5 y L7), que indicaban un alto grado de flexibilidad conformacional para estas proteínas. La determinación y análisis estructural del complejo FaFra3-catequina, resultó esencial para para establecer definitivamente la capacidad de las proteínas FaFra de unir flavonoides naturales asi como para comprender el mecanismo de actuación de esta familia de proteínas. La unión del metabolito en la cavidad central de FaFra3, daba lugar a un cambio conformacional en la proteína esencial para la estabilidad del complejo formado (Figura 4, Capítulo 3). Los giros altamente flexibles observados en las formas apo de FaFra1E, adoptaban en este complejo una conformación única, curvándose hacia la cavidad central para adoptar una conformación cerrada que estabiliza el ligando en el interior de la cavidad. El plegamiento global se veía afectado también por el cambio conformacional de la hélice α3, cuya contribución daba lugar a una estructura general más compacta de la proteína en presencia de ligando. Uno de los principales resultados de este análisis ha sido la identificación de los residuos aminoacídicos involucrados en la unión de ligandos en la cavidad central de los alérgenos así como los residuos esenciales implicados en la formación de dicha cavidad. Esto ha permitido caracterizar no sólo aquellos amino ácidos fundamentales en la unión de la catequina a FaFra3 y aquellos conformando la cavidad, sino también aquellos residuos variables entre las distintas proteínas (Figura 5, Capítulo 3), que podrían ser la respuesta a la diferencia en especificidad de ligando observada para estas proteínas.
En resumen, los experimentos de interacción de las proteínas FaFra1E, FaFra2 y FaFra3 con distintos compuestos flavonoides de la ruta de biosíntesis de antocianos, ha permitido identificar un ligando natural y diferente para cada una de estas proteínas, lo que sugiere que cada una de las proteínas FaFra podría estar desempeñando una función diferente en el control de esta ruta metabólica. La cristalización y determinación estructural de FaFra1E y FaFra3 en complejo con el ligando flavonoide identificado (catequina), ha revelado una información muy valiosa sobre el posible mecanismo de actuación de estas proteínas. Los resultados obtenidos, ponen de manifiesto una vez más la relación existente entre las proteínas FaFra y la ruta de biosíntesis de flavonoides y sugieren dos hipótesis principales sobre la función de FaFra en esta ruta metabólica a nivel molecular. Por un lado, las proteínas FaFra podrían funcionar como transportadores de metabolitos, trasladando compuestos flavonoides desde su lugar de síntesis (retículo endoplasmático) hasta su destino final, generalmente la vacuola o la pared celular. Se sabe que las principales enzimas de la ruta de biosíntesis de fenilpropanoides y flavonoides co-localizan en la cara citosólica del retículo endoplasmático de muchas especies vegetales diferentes (Winkel, 2004). De este modo, FaFra podría ser un componente esencial de estos complejos multiproteicos responsables de la biosíntesis de flavonoides, donde estarían facilitando la disponibilidad de los distintos intermediarios metabólicos, para su uso por las enzimas procesadoras de la ruta, en el momento necesario. Por otro lado, las proteínas FaFra parecen ejercer un papel regulador de la ruta de biosíntesis de flavonoides a nivel transcripcional y podrian funcionar como componentes tempranos de una cascada de señalización. El hecho de que el silenciamiento de FaFra afecte tanto a la expresión de genes esenciales de la ruta de biosíntesis de flavonoides (PAL, CHS, C4H, 4CL, CHI, DRF, F3H, 3-GT) como a la expresión de factores de transcripción involucrados en el control de la misma (FaMYB1, FaMYB10), sumado al hecho de que estas proteínas son capaces de unir distintos compuestos flavonoides, sugiere que las proteínas FaFra podrían estar regulando el flujo de metabolitos en la ruta, lo que se traduciría en una regulación transcripcional indirecta de los genes principales de la ruta. De forma global, este estudio propone un papel para las proteínas PR-10 de control del metabolismo secundario en plantas que no había sido descrito hasta el momento.
CONCLUSIONES GENERALES
1. Análisis del transcriptoma de fresa (Fragaria xananassa) a lo largo del desarrollo y maduración ha permitido la identificación de 10 genes FaFra putativos, y un número de variedades alélicas.
2. El análisis del perfil de expresión de los transcritos FaFra indica que cada uno de los miembros de la familia presenta un patrón de expresión diferencial en los distintos tejidos vegetativos estudiados y a lo largo de la maduración del fruto, lo que apunta hacia la posibilidad de que las proteínas FaFra puedan presentar especificidad de unión de ligando y funciones diferenciales.
3. El silenciamiento de los genes FaFra2A y FaFra6 en la fresa conlleva la represión de genes que codifican enzimas principales de la ruta de biosíntesis de flavonoides y de factores de transcripción de tipo MYB. Este resultado, respalda el papel de regulación que las proteínas FaFra ejercen en la ruta de biosíntesis de flavonoides.
4. Las proteínas FaFra1E, FaFra2 y FaFra3 son capaces de unir de forma selectiva distintos flavonoides naturales con diferente afinidad en el rango micromolar.
5. La unión de flavonoides naturales en la cavidad hidrofóbica de las proteínas FaFra induce una serie de cambios conformacionales que estabilizan el complejo FaFra-ligando. Estos cambios conformacionales podrían tener relevancia funcional.
6. La variabilidad de secuencia observada en el sitio de unión de la cavidad central en las proteínas FaFra, podría ser la explicación a la distinta selectividad de ligandos determinada para cada una de las proteínas. Por primera vez, nuestros resultados proporcionan detalles mecanísticos sobre la función de las proteínas FaFra en el control de la ruta de biosíntesis de flavonoides.
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