Nuevas perspectivas moleculares y agronómicas de la resistencia a fungicidas en Podosphaera fusca

Abstract

El cultivo de las cucurbitáceas es de especial importancia en España. Una limitación importante de estos cultivos es el desarrollo de enfermedades. El oídio de las cucurbitáceas (Podosphaera fusca) ha sido descrito como una de las principales enfermedades que afecta a estos cultivos. Los síntomas se caracterizan por la aparición de manchas redondeadas de color blanquecino y aspecto pulverulento, que se extienden gradualmente sobre las hojas y tallos, provocando la senescencia temprana de la planta, así como importantes reducciones en la cantidad, calidad y tamaño de los frutos. El uso de cultivares resistentes, organismos antagonistas y fungicidas, son las principales herramientas para el control de la enfermedad. Actualmente aunque se desarrollan estrategias de control integrado que combinan todas estas herramientas, el uso extensivo de fungicidas es la principal estrategia de control, ya que al ser P. fusca un hongo de desarrollo externo en la planta, el fungicida entra fácilmente en contacto con él. Destaca el uso de fungicidas sistémicos, que son absorbidos por la planta y transportados por el xilema, siendo inocuos para la planta y suelen actuar de forma específica en los hongos. El uso de estas materias se convierte en un arma de doble filo, ya que al ser compuestos muy específicos afectan a puntos concretos del patógeno, pero este puede desarrollar fácilmente mecanismos de resistencia. En España, el control del oídio de las cucurbitáceas provocado por Podosphaera fusca se basa principalmente en el uso de compuestos químicos como los fungicidas QoI (inhibidores de la cadena respiratoria) y los fungicidas DMI (inhibidores de la síntesis de ergosterol). Estos productos han perdido parte de su eficacia debido a la aparición de cepas resistentes, lo que ha conducido en muchos casos al fracaso de las estrategias de control de la enfermedad. Trabajos anteriores, se detectaron elevadas frecuencias de aislados resistentes de P. fusca en las principales zonas de producción de cucurbitáceas. Por ello, entre los objetivos del presente estudio se ha profundizado en el conocimiento de los diferentes mecanismos moleculares implicados en la resistencia a los fungicidas QoI y DMI en P. fusca en España. Los fungicidas QoI son un importante grupo de fungicidas que actúan inhibiendo la cadena respiratoria, actuando en el sitio de oxidación del ubiquinol (Qo) Éste Qo se encuentra en el citocromo bc1 (CYTBC1); formado por el citocromo b (CYTB), citocromo c1 (CYTC1) y dominios de la sulfo-proteína de Rieske (ISP). La inhibición de la respiración mitocondrial se logra mediante el bloqueo del transporte de electrones entre el citocromo b (CYTB) y citocromo c1 (CYTC1), que en consecuencia conduce a una interrupción del ciclo de energía suspendiendo la producción de ATP. Hasta ahora, el mecanismo por el cual las poblaciones de P. fusca en España adquirían la resistencia a estos fungicidas no estaba claro. En estudios previos, la inducción de una respiración alternativa sostenida por la oxidasa fue descartada. En este trabajo, el papel del CYTB en la resistencia a fungicidas QoI ha sido re-analizado mediante el examen molecular de una colección de cepas de P. fusca. Nuestros datos sugieren que el mecanismo responsable de la resistencia QoI en P. fusca es la típica mutación G143A en el CYTB y que la proporción de mitocondrias mutadas es un factor importante para el desarrollo de la resistencia. Además, existen otros mecanismos alternativos que pueden estar implicados en la resistencia a fungicidas. En la naturaleza, los hongos filamentosos están expuestos a una amplia variedad de compuestos tóxicos como pueden ser los fungicidas. Así, gracias a la participación de los transportadores de membrana, los hongos pueden autoprotegerse contra la acción de toxinas exógenas y endógenas.Estudiamos el papel de estos transportadores en aislados resistentes a fungicidas QoI y DMI, utilizando moléculas fluorescentes e incubando con diferentes protonóforos para conocer su carácter bioenergético. Se observó una sobreexpresión de transportadores tipo ABC en cepas resistentes a fungicidas QoI y DMI en P. fusca. Además, aislamos un fragmento de un supuesto gen tipo ABC en P. fusca (PfABC1), del cual se analizó su expresión en presencia de fungicidas. Los resultados indicaron que PfABC1 parece estar implicado en la protección de P. fusca frente a la toxicidad de fungicidas DMI. Además, debido a las elevadas frecuencias de aislados resistentes de P. fusca a fungicidas QoI y DMI, realizamos estudios de fitness cost asociados a estas resistencias. El fitness cost asociado a la resistencia a fungicidas es un parámetro fundamental para la utilización de fungicidas en programas de gestión de resistencias. Sirve para determinar el resultado de la competencia entre las cepas resistentes y sensibles de patógenos, así como para evaluar la utilidad de los fungicidas a medio y largo plazo. Estudiamos la germinación de conidios, y el tamaño de la colonia en cepas sensibles y resistentes a fungicidas QoI y DMI. Comparamos los datos obtenidos a diferentes condiciones de temperatura, entre las diferentes cepas sensibles y resistentes de P. fusca a los fungicidas QoI y DMI. Los valores de germinación en el grupo de los aislados resistentes a fungicidas QoI presentaron valores significativamente más altos que los del grupo de los aislados sensibles, mientras que el grupo de los aislados resistentes a fungicidas DMI presentaron valores significativamente más bajos que los del grupo de los aislados sensibles. Con respecto a los valores de crecimiento no detectamos diferencias en ninguno de los grupos de resistencia (a fungicidas QoI o DMI) frente al de los sensibles. Los resultados indicarían que no se detectó coste de fitness asociado a la resistencia a fungicidas QoI en ninguno de los parámetros estudiados. Sin embargo, sólo algunos valores de germinación presentaron un coste de fitness asociado a la resistencia a fungicidas DMI. Estos resultados sugieren que el uso de fungicidas QoI debería limitarse puesto que implicaría la selección de cepas resistentes sin ningún tipo de coste. Esto se traduciría en la aparición de una población mayoritaria estable y resistente a fungicidas QoI con el paso del tiempo. Con respecto al uso de fungicidas DMI, podríamos seguir utilizándolos moderadamente, o en combinación con otros fungicidas de diferente modo de acción. Tras profundizar nuestro conocimiento sobre los mecanismos moleculares implicados en la resistencia a los principales grupos de fungicidas utilizados para P. fusca frente, creímos de gran interés aportar información detallada sobre la distribución y niveles de resistencia a otros fungicidas utilizados en España para el control del oídio de las cucurbitáceas. Se realizaron ensayos de discos estudiando la sensibilidad frente a bupirumato, quinoxifen y metiltiofanato en una colección de 237 aislados recolectados entre los años 2002-2011 en las principales zonas productoras de cucurbitáceas. Los resultados obtenidos fueron unos elevados niveles de resistencia frente a metiltiofanato, sugiriendo su falta de utilidad para el control del oídio de las cucurbitáceas. Sin embrago, no se detectó resistencia a bupirumato y quinoxifén, lo que indica que siguen siendo materias efectivas contra el control de la enfermedad.