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dc.contributor.advisorCazorla, Francisco M.
dc.contributor.authorEscaño-Calderón, Claudia
dc.contributor.otherMicrobiologíaes_ES
dc.date.accessioned2014-07-21T10:05:45Z
dc.date.available2015-07-18T04:00:03Z
dc.date.issued2014
dc.identifier.urihttp://hdl.handle.net/10630/7872
dc.description.abstractPseudomonas chlororaphis PCL1606 es una rizobacteria que muestra capacidad antagonista y actividad de biocontrol frente a diferentes hongos fitopatógenos de suelo. Esta cepa fue aislada inicialmente de la rizosfera de árboles de aguacate sanos, creciendo en un área afectada por la podredumbre blanca radicular en la zona de la Axarquía en la provincia de Málaga. Pseudomonas chlororaphis PCL1606 fue inicialmente seleccionada por su elevada capacidad antagonista frente a Rosellinia necatrix, el agente causal de la podredumbre blanca radicular (Cazorla et al., 2006). Los experimentos de laboratorio realizados con P. chlororaphis PCL1606 han mostrado que además presenta una marcada capacidad de biocontrol frente a distintos hongos patógenos de suelo (Cazorla et al., 2006; González-Sánchez et al., 2013). El análisis de la producción in vitro de antibióticos antifúngicos reveló la presencia de 2-hexil, 5-propil resorcinol (HPR). Posteriores estudios sobre la capacidad antagonista de P. chlororaphis PCL1606, la han correlacionado con la producción de HPR (Cazorla et al., 2006). Hasta el momento, las bases genéticas de la producción de HPR habían sido propuestas únicamente para la cepa P. chlororaphis subsp. auranthiaca BL915, donde se descubrió que los genes implicados en la producción de HPR se encontraban formando parte de un grupo de genes compuesto por tres potenciales genes biosintéticos (darA, darB y darC) seguido de dos posibles genes reguladores (darS y darR; Nowak-Thompson et al., 2003). En trabajos anteriores a ésta tesis, se había detectado la presencia del gen darB in P. chlororaphis PCL1606 mediante amplificación por PCR, lo que sugería la presencia de los genes dar en el genoma de ésta batería. Por lo que, un objetivo de este trabajo fue la detección y localización de los genes dar en el genoma de P. chlororaphis PCL1606 (Capítulo II). En nuestro laboratorio ya se disponía de una genoteca genómica en fagémidos de P. chlororaphis PCL1606. Por ello, se construyeron sondas heterólogas de todos los genes dar construidas a partir del ADN de P. chlororaphis subsp. auranthiaca BL915. El rastreo de ésta genoteca genómica empleando dichas sondas, permitió seleccionar un plásmido de 12,123 pb denominado pCGNOV-1, que mostraba hibridación con las cinco sondas empleadas. La posterior secuenciación y el análisis informático del ADN genómico en éste plásmido reveló que albergaba 13 ORFs, de los cuales, cinco de ellos mostraban una elevada homología a los genes dar previamente descritos en P. chlororaphis subsp. auranthiaca BL915. Además se observó una sintenia de los genes dar similar a la mostrada en otras cepas como P. chlororaphis subsp. aurantiaca BL915, P. chlororaphis subsp. aureofaciens 30-84 y P. chlororaphis 06. Es destacable que la comparación de estos genes dar en P. chlororaphis PCL1606 con otros genes con secuencias homólogas y presentes en otros microorganismos aislados desde ambientes como suelo o agua, mostraron un menor grado de similitud, lo que sugiere que estas secuencias de los genes dar son altamente específicas para el grupo de Pseudomonas chlororaphis y microorganismos muy relacionados. Una vez localizada la presencia de los genes dar en el genoma de P. chlororaphis PCL1606, se procedió a determinar el papel de cada uno de estos genes en la biosíntesis de HPR, así como en la capacidad de biocontrol de ésta cepa. Para ello se construyeron mutantes dirigidos en cada uno de los genes dar, por recombinación homóloga simple, mediante electroporación de un plásmido constituido por un fragmento de cada uno de los genes dar clonado en el plásmido integrativo pCR2.1. Una vez obtenidos y seleccionados los mutantes, se caracterizaron aspectos fenotípicos como los parámetros de crecimiento en diferentes medios de cultivo, comprobando que los mutantes no estaban afectados en crecimiento. Además, para demostrar la posible implicación de los mutantes de cada uno de los genes dar en la producción de HPR, se procedió a detectar su presencia in vitro. Para la detección de HPR, se siguió el método descrito en Cazorla et al. (2006), empleando extractos orgánicos de cultivos de 5 días en medio triptona-peptona-glicerol (TPG). Para su análisis, estos extractos orgánicos se fraccionaron empleando técnicas de cromatografía en capa fina (TLC), permitiendo la detección de distintos compuestos mediante observación bajo luz ultravioleta a 254 nm como tras la aplicación del reactivo ácido sulfanílico diazotizado (DASA; Whistler et al., 2000). Éste análisis mostró que solo los mutantes dirigidos en darA y darB perdían su capacidad de producir HPR, por lo que se construyeron los correspondientes complementantes en estos mutantes defectivos en la producción en HPR. Se les incorporó una copia intacta de los genes interrumpidos en un vector plasmídico, y se observó que la producción de HPR se veía restaurada en los correspondientes complementantes. De esta manera, queda confirmado el papel crucial de darA y darB en la biosíntesis del HPR. El análisis bioinformático de éstos genes (darA y darB) identificó la función de cada uno de ellos, confirmando lo previamente descrito como principales genes biosintéticos (Nowak-Thompson et al., 2003). Por lo otro lado, el mutante dirigido en el gen darC continua produciendo HPR, si bien en cantidad ligeramente mas reducida, apoyando su papel en la modificación parcial de la molécula (Nowak-Thompson et al., 2003). Por otro lado, los mutantes dirigidos en los genes darS y darR continúan produciendo HPR. No están considerados genes biosintéticos y mediante análisis bioinformáticos, la función predicha para ambos genes fue la de reguladores transcripcionales. Éstos genes presentan una alta homología con los genes reguladores pertenecientes a la familia araC/xylS, que se caracterizan por ser reguladores positivos en distintos procesos biológicos de los microorganismos, entre otros, en la producción de algunos metabolitos secundarios (Gallegos et al., 1997). La capacidad antagonista de los mutantes dirigidos se evaluó frente a los hongos fitopatógenos R. necatrix y Fusarium oxysporum, y reveló un antagonismo muy reducido para los mutantes en los genes darA y darB, confirmando claramente su correlación con la producción de HPR. Éste resultado confirma el papel crucial de los genes darA y darB en el fenotipo antagonista de P. chlororaphis PCL1606. Por el contrario, los mutantes dirigidos en los genes darC, darS y darR, además de seguir produciendo HPR, presentaron similar actividad antagonista frente a ambos hongos fitopatógenos cuando se compararon con la cepa silvestre.es_ES
dc.language.isoenges_ES
dc.publisherUniversidad de Málaga, Servicio de Publicaciones y Divulgación Científicaes_ES
dc.rightsinfo:eu-repo/semantics/openAccess
dc.subjectHongos fitopatógenos - Control biológico - Tesis doctoraleses_ES
dc.subject.otherBiocontroles_ES
dc.subject.otherAntibioticses_ES
dc.subject.otherRegulationes_ES
dc.subject.otherGenomees_ES
dc.subject.otherBiosynthesises_ES
dc.titleGenetical bases of 2-hexyl, 5-propyl resorcinol production and its role in the multitrophic interactions during biocontroles_ES
dc.typeinfo:eu-repo/semantics/doctoralThesises_ES
dc.centroFacultad de Cienciases_ES


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