Exploring the functional interactions between geminivirus and host

Abstract

Los geminivirus son virus de plantas con genomas circulares de DNA de cadena sencilla que infectan numerosas especies de interés agronómico en todo el mundo, provocando cuantiosas pérdidas que pueden llegar hasta el 100% de la cosecha. Los genomas de estos virus están muy reducidos, y codifican sólo 6 u 8 proteínas, dependiendo de la especie. Esta reducción genómica hace que el virus dependa de factores celulares para el desarrollo de la infección y la compleción de su ciclo vital, incluyendo las fases de replicación y tráfico dentro de la célula o en la planta. Dado que los geminivirus precisan proteínas de la planta hospedadora, la identificación de dichas proteínas supondría un importante paso hacia la comprensión del proceso de infección, lo que en último término podría suponer un importante aporte en la lucha contra la enfermedad. El objetivo de éste trabajo consiste en explorar las interacciones funcionales entre los geminivirus y sus hospedadores. En el primer capítulo se estudió la importancia de la proteína C2 de los geminivirus durante la señalización de jasmonatos (JA) y la respuesta de defensa en planta. Trabajos previos en nuestro grupo mostraron que la expresión de las proteínas C2 es capaz de interferir con la ruta de ubiquitinación en plantas de Arabidopsis. Con la finalidad de estudiar más a detalle el efecto que tiene la expresión de C2 en Arabidopsis, se hizo un análisis de microarray. El análisis transcriptómico de las plantas transgénicas expresan C2 de Tomato yellow curl Sardinia virus (TYLCSV) reveló que C2 altera múltiples procesos celulares. Entre los procesos más destacados están la represión de la respuesta a JA y al metabolismo secundario. Además, el análisis transcriptómico de las plantas transgénicas de Arabidopsis que expresan C2 tratadas con JA exógeno, puntualizó que la represión causada por C2 es a través la respuesta específica de genes inducidos por JA; por lo tanto es dudoso que ésta inhibición sea a través de la inhibición de la E3-ligasa SCFCOI1. Por otro lado, observamos que la proteína C2 interacciona en levaduras e in planta con la proteína represora de la respuesta a JA llamada JAZ8. Por lo tanto, hemos propuesto que la proteína C2 de los geminivirus podría estar interfiriendo con la respuesta a JA en varios niveles. El segundo capítulo tuvo como objetivo llevar a cabo la identificación de genes del hospedador involucrados en la infección por geminivirus usando una aproximación de genética reversa. Para llevar a cabo esto, usamos plantas transgénicas de Nicotiana benthamiana denominadas 2IRGFP. Estas plantas presentan una sobreexpresión de la GFP dependiente de la actividad de la proteína viral Rep de TYLCSV, que dispara la formación de replicones mGFP. La acumulación de GFP actúa como marcador de la replicación de TYLCSV, permitiendo la detección y seguimiento de este proceso de manera rápida, sencilla, semi-cuantitativa y a tiempo real. Además, en combinación con una técnica de silenciamiento como el silenciamiento génico inducido por virus (VIGS), las plantas 2IRGFP son una poderosa herramienta en estudios de genética reversa dirigidos a la identificación de genes de la planta necesarios para la infección viral. Siguiendo este concepto, se silenciaron 37 genes candidatos en las plantas 2IRGFP a las que paralelamente se infectaron con TYLCSV. De acuerdo con el efecto de su silenciamiento sobre la infección TYLCSV, medida como tiempo de aparición y la intensidad de la expresión de GFP, se agruparon los genes del huésped en tres clases: aquellos cuyo silenciamiento no causó cambios en la expresión (grupo A), o aquellos cuya silenciamiento adelantó (grupo B) o por el contrario retrasó o llegó a ser nula (grupo C) la expresión de GFP. En total hemos identificado 18 genes implicados en varios procesos celulares cuyos silenciamiento altera infección TYLCSV. En particular, 15 de estos genes son descritos por primera vez como factores implicados en infecciones virales. Por lo tanto, nuestros resultados proporcionan nuevos conocimientos sobre los posibles mecanismos moleculares que subyacen a las infecciones por geminivirus, y al mismo tiempo revelan el sistema 2IRGFP/ VIGS como una poderosa herramienta para los estudios de genética funcional reversa. Como tercera meta nos propusimos analizar el papel que cumple el tráfico vesícula retrogrado durante la infección por geminivirus. Éste capítulo se inició por el sorprendente hallazgo que se obtuvo en el segundo capítulo del presente trabajo, donde observamos que silenciamiento del gen que codifica para subunidad delta del complejo de coatomero COPI (-COP) imposibilita por completo la infección de TYLCSV en plantas de N. benthamiana. Para obtener mayor información sobre el rol del tráfico retrógrado sobre la infección por geminivirus, decidimos silenciar otro gen implicado en ésta ruta. Este gen fué ADP-ribosilación 1 (ARF1), la GTPasa específica que impulsa la formación de las vesículas de COPI. Observamos que los geminivirus TYLCSV y Beet curly top virus no infectan plantas de N. benthamiana donde se silenciaron los genes -COP como ARF1. Además pudimos concluir que es un efecto específico de los geminivirus, porque al infectar con otros patógenos como virus de RNA y Pseudomonas syringae pv tomato no se observó ningún efecto. En resumen, los geminivirus requieren un sistema de transporte retrógrado activo. El silenciamiento génico de dos de los principales componentes de ésta ruta afecta negativamente la infección de TYLCSV y BCTV, pero no altera la interacción con otros patógenos de planta.