Estudio sobre la interacción planta geminivirus.

Abstract

Los geminivirus son virus de plantas con genomas de DNA monocatenario formados por una (monopartitos) o dos (bipartitos) moléculas de DNA que codifican de seis a ocho proteínas. Estos virus causan importantes pérdidas económicas en cultivos comerciales de todo el mundo. La familia Geminiviridae comprende siete géneros (Mastrevirus, Curtovirus, Begomovirus, Topocuvirus, Becurtovirus, Eragrovirus y Turncurtovirus) en los que se encuadran los distintos geminivirus en función de su rango de hospedador y su insecto vector. En esta tesis nos centramos en virus del género Begomoviridae. Para que los geminivirus puedan establecer una infección exitosa su hospedador, deben ser capaces de ser transportados por su insecto vector, llegar al núcleo de las células del floema, replicar su DNA, expresar sus proteínas, contrarrestar los sistemas de defensa de la planta y moverse a células adyacentes o a otras distantes a través del sistema vascular de la planta para extender la infección. Todo esto no sería posible con tan solo seis u ocho genes sin la intervención de factores celulares de la planta. Los geminivirus son capaces de secuestrar los factores y mecanismos de la planta y usarlos en su beneficio. En esta tesis se abordan tres aspectos del estudio de estos virus: - Interferencia en la sumoilación de PCNA. - Generación de nuevas herramientas moleculares para la visualización in vivo de la infección por geminivirus. - Efecto de los estreses abióticos sobre la infección por geminivirus.

Interferencia en la sumoilación de PCNA. PCNA es una proteína que interacciona con el DNA y con el replisoma, formado por diversos factores celulares implicados en la replicación, reparación y recombinación del mismo. Lleva a cabo su función proporcionándoles un anclaje para interactuar entre ellos y con el DNA. PCNA está finamente regulado mediante la adición y retirada de modificaciones post-traduccionales. Entre estas, destacan la ubiquitinación y la sumoilación, que determinan la maquinaria de replicación o reparación que se carga en el replisoma. En levaduras, cuando se desumoila la lisina 164 de PCNA, este cambia su abanico de interactores y carga polimerasas de DNA que tienden a cometer herrores y factores celulares que favorecen la recombinación homóloga. Rep es la proteína vírica responsable del inicio de la replicación. Interacciona con PCNA y con la maquinaria de sumoilación de la célula. En esta tesis se estudian varios aspectos de la interferencia de la proteína viral Rep con la sumoilación del factor celular PCNA.

Generación de nuevas herramientas moleculares para la visualización in vivo de la infección por geminivirus. Las plantas 2IR son plantas de Nicotiana benthamiana transgénicas que contienen un casete de expresión de GFP (green fluorescent protein) flanqueado por dos repeticiones directas de la región intergénica de TYLCSV (Tomato yellow leaf curl Sardinia virus). La región intergénica es la parte del genoma de los geminivirus en la que se encuentran su origen de replicación y las secuencias reguladoras necesarias para la expresión de sus genes. Cuando un geminivirus infecta una célula que contiene la construcción 2IR, la proteína Rep expresada por el virus se une a las regiones intergénicas de la construcción y la escinde, formando una molécula extracromosómica que contiene el casete de expresión de GFP y una región intergénica, que permite que esta molécula extracromosómica se replique como un virus. El incremento de moléculas extracromosómicas conlleva un incremento sustancial en la expresión de GFP. Esto permite seguir el desarrollo de la infección en plantas vivas con una lámpara de luz ultravioleta sin necesidad de dañarlas. Estas plantas se han usado en varios estudios ya publicados en los que se han identificado factores celulares del hospedador implicados en la infección del virus o se ha indagado en las relaciones sinérgicas entre distintos virus de la misma familia. En el tercer capítulo de esta tesis se usan para estudiar el efecto de los estreses abióticos sobre la infección por geminivirus. Pese al enorme potencial de estas plantas, tienen limitaciones, como por ejemplo la enorme especificidad que tienen las proteínas Rep de los distintos geminivirus por la región intergénica de su virus. Esto impide usar las plantas 2IR para estudiar el desarrollo de la infección de TYLCV-IL (Tomato yellow leaf curl virus – Israel), el que se ha convertido en el virus con mayor incidencia en los últimos años. Otro problema es que la GFP fluoresce en N. benthamiana pero no en tomate, el hospedador de estos virus con mayor trascendencia económica. Durante el desarrollo de esta tesis se generaron nuevas versiones de las plantas 2IR con regiones intergénicas de TYLCV-IL y con fluoróforos que sí fluorescen en tomate. También se caracterizó el fenotipo de estas plantas en respuesta a la infección por los virus del complejo TYLCD.

Efecto de los estreses abióticos sobre la infección por geminivirus. Durante la primera mitad del siglo XXI se van a consumir más alimentos que durante toda la historia de la humanidad. Producir estos alimentos es un reto que empeora teniendo en cuenta la situación de calentamiento global, desertización y salinización de los acuíferos que se da en muchas partes del globo. Además de estas fuentes de estrés, los cultivos deben sobrevivir a los virus y otros patógenos. Existen multitud de estudios en los que se exploran los efectos de estos factores sobre las plantas, pero apenas hay algunos que estudien la interacción de estos factores. En esta tesis se propone un sistema experimental en el que se pueden estudiar in vivo los efectos de temperatura, salinidad, sequía e infección por geminivirus sobre las plantas durante largos períodos de tiempo y sin necesidad de sacrificar las plantas, lo que permite hacer un seguimiento individualizado a lo largo del tiempo de un mismo proceso infectivo.